Biorefinery development using winery waste streams processed via novel lignocellulose pretreatment technologies and industrial fermentations for the production of bioeconomy products

Abstract

The scope of this thesis is to investigate the development of an integrated and multifunctional biorefinery, utilising by-product streams generated from the winemaking process (grape pomace, stalks and wine lees) for the sustainable production of value-added products and chemicals using novel technologies for the pretreatment of lignocellulosic biomass. The study was initiated with the compositional analysis of grape pomace and stalks generated after the wine making process of Agiorgitiko variety. Grape pomaces were initially processed for water extraction of free sugars followed by phenolic and lipid extraction with ethanol and hexane, respectively. The remaining solids were mixed with grape stalks (1:1 ratio) and treated with 1% (w/v) sodium hydroxide at 100°C for 3 h for lignin removal. The residual solids were hydrolysed with varying H2SO4 concentrations (3, 5, 7%, v/v) at 100°C for 40 min for hemicellulose hydrolysis. The remaining solids were subjected to enzymatic hydrolysis using different dosages of cellulases and β-glucosidase leading to the release of 22.7 g glucose per 100 g remaining solids (48% glucan hydrolysis). The crude hydrolysate was used in Actinobacillus succinogenes cultures for the production of succinic acid (SA). Fed-batch cultures initiated with the crude hydrolysate and using the free sugar fraction and yeast extract as feeding solution resulted in the highest succinic acid concentration (40.2 g/L) with a yield of 0.67 g/g and productivity of 0.79 g/(L·h). These results indicate that grape pomace and stalks could be utilised as an alternative substrate for the production of succinic acid and other value-added products, proposing a sustainable process for valorising winery wastes. Besides succinic acid, various winery waste streams have been used in this PhD thesis for biorefinery development. Four grape pomace streams were initially mixed and fractionated into various fractions. The free sugar stream (12.3 g/100 g) was bioconverted to bacterial cellulose using the bacterial strain Komagateibacter sucrofermentans. Subsequently, grape-seed oil was extracted from grape pomace streams with ethyl lactate, a more environmentally friendly alternative to conventionally used hexane. An oil recovery of 35.7% was achieved, while the fatty acid profile revealed abundance of linoleic acid. Phenolic compounds in the remaining grape pomaces were extracted with aqueous ethanol at different solid-to-solvent ratios. The remaining grape pomace solids were mixed with grape stalks and subjected to delignification with NaOH employing experimental design for process optimisation. The optimal concentration of NaOH (1.19% w/v), temperature (70oC), and time (30 min) resulted in high lignin removal (50.8%) and low hemicellulose (29.8%) and cellulose losses (23.6%). The lignin- and tannin-rich stream from the delignification liquid was subjected to Stiasny number analysis (76%), while the delignified solids were enzymatically hydrolysed to produce a sugar-rich hydrolysate (40.3 g/L sugars). In parallel, ethanol, antioxidants and tartaric acid were recovered from wine lees. The protein content of wine lees was enzymatically hydrolysed to be used as nitrogen source for bacterial fermentations. Enzymatic hydrolysates were combined and used as substrate for succinic acid production by A. succinogenes leading to 24.9 g/L succinic acid in batch fermentation mode and 37.2 g/L in fed-batch fermentation mode. The proposed biorefinery led to the production of 42.65 g bacterial cellulose, 24.3 g seed oil, 40.3 g phenolic-rich extract (with 1.41 antioxidant activity index), 40.1 g ethanol, 624.8 g crude tannin extract, 20.0 g tartaric acid and 157.8 g succinic acid. The PhD thesis subsequently focused on the utilisation of Deep Eutectic Solvents (DES) for the pretreatment of grape pomace and stalks within the biorefinery concept. Four DES produced with choline chloride as hydrogen bond acceptor and four carboxylic acids as hydrogen bond donors, namely formic acid, acetic acid, lactic acid (LA) and oxalic acid, were evaluated considering lignin removal efficiency, polysaccharide hydrolysis efficiency into C5 and C6 sugars, recyclability and reusability. Using the mixture ChCl:LA at 1:10 molar ratio, at 120°C and 1 h pretreatment, led to 40% lignin removal over four pretreatment cycles. Enzymatic hydrolysis of the remaining solids after the first pretreatment cycle resulted in 92.7% glucan and 36.6% hemicellulose hydrolysis yield. The hydrolysate was used as fermentation feedstock in batch A. succinogenes bioreactor cultures leading to 36 g/L succinic acid with a yield of 0.60 gSA/g total sugars and a productivity of 0.65 g/(L·h). Using 2 kg of grape pomace and stalks in each DES pretreatment cycle, the succinic acid that could be produced in five consecutive cycles is 200.8 g, 208 g, 204.9 g, 184.5 g and 94.3 g. The PhD thesis finally focused on the evaluation of non-thermal dielectric barrier discharge (DBD) air plasma for sustainable pretreatment of lignocellulosic biomass. This process could eliminate the use of harmful chemicals, high temperatures and pressures used in conventional thermochemical pretreatment processes. Within this context, grape stalks were investigated after non-thermal air plasma pretreatment for succinic acid production by Actinobacillus succinogenes. The effect of various operating parameters of DBD air plasma treatment (e.g., grape stalks particle size, aeration, pretreatment duration, duty cycle, initial solids concentration) on grape stalks hydrolysis efficiency and succinic acid production was evaluated. Pretreatment of 150 g/L grape stalks (<0.25 mm particle size) for 60 min at 20% duty cycle and 2.5 vvm aeration led to 85.2% glucan and 50.4% hemicellulose hydrolysis yield that is 2-fold and 3.3-fold higher than the hydrolysis yield achieved without pretreatment. Major advantage of DBD air plasma treatment is the utilisation of both solid and liquid fractions in enzymatic hydrolysis and the potential to achieve simultaneous pretreatment and sterilization. The grape stalks hydrolysate was used in A. succinogenes cultures to produce 37.1 g/L succinic acid with 0.68 gSA/gtotal sugars yield and 0.65 g/(L·h) productivity, which was similar to the fermentation efficiency achieved with commercial fermentation media.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της δυνατότητας ανάπτυξης ενός ολοκληρωμένου βιοδιυλιστηρίου, χρησιμοποιώντας παράπλευρα ρεύματα που προκύπτουν από τη διαδικασία οινοποίησης (στέμφυλα, βόστρυχοι και οινολάσπη) για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας και χημικών ουσιών, χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνολογίες προεπεξεργασίας της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας. Η μελέτη ξεκίνησε με την ανάλυση της σύστασης στεμφύλων και βοστρύχων που προέκυψαν από την οινοποίηση της ποικιλίας Αγιωργίτικο. Αρχικά, τα στέμφυλα υποβλήθηκαν σε εκχύλιση με νερό για την παραλαβή των ελεύθερων σακχάρων, ενώ ακολούθησε εκχύλιση με αιθανόλη και εξάνιο για παραλαβή των φαινολικών ουσιών και ελαίων αντίστοιχα. Τα υπολειπόμενα στερεά αναμίχθηκαν με βοστρύχους (αναλογία 1:1) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% (w/v) NaOH στους 100°C για 3 ώρες με στόχο την απομάκρυνση της λιγνίνης. Τα εναπομείναντα στερεά υδρολύθηκαν με χρήση διαφορετικών συγκεντρώσεων H2SO4 (3, 5, 7%, ν/ν) στους 120°C για 40 λεπτά, με σκοπό την υδρόλυση της ημικυτταρίνης. Στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε ενζυμική υδρόλυση χρησιμοποιώντας διαφορετικές αναλογίες κυτταρινασών και β-γλυκοσιδάσης που οδήγησε στην παραγωγή 22,7 g γλυκόζης ανά 100 g εναπομείναντων στερεών (48% υδρόλυση γλυκάνης). Το υδρόλυμα χρησιμοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα σε ζυμώσεις με το βακτηριακό στέλεχος Actinobacillus succinogenes για παραγωγή ηλεκτρικού οξέος. Η πηγή άνθρακα στην αρχή κάθε ζύμωσης ήταν υδρόλυμα ενώ η τροφοδοσία αποτελούνταν από ελεύθερα σάκχαρα στεμφύλων και προσθήκη εκχυλίσματος ζύμης. Με χρήση αυτών, επιτεύχθηκε η υψηλότερη συγκέντρωση ηλεκτρικού οξέος (40,2 g/L) με απόδοση 0,67 g/g και παραγωγικότητα 0,79 g/(L·h). Έτσι αποδεικνύεται ότι τα στέμφυλα και οι βόστρυχοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος και άλλων προϊόντων προστιθέμενης αξίας, προτείνοντας με αυτό τον τρόπο μια βιώσιμη διαδικασία για την αξιοποίηση των αποβλήτων οινοποιείων. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε ένα πρότυπο βιοδιυλιστήριο με χρήση αποβλήτων οινοποιείων που προέρχονται από τέσσερις ελληνικές ποικιλίες οινοποίησης. Τα στέμφυλα αναμίχθηκαν και βελτιστοποιήθηκε ο διαχωρισμός διαφορετικών κλασμάτων. Αρχικά τα ελεύθερα σάκχαρα (12,3 g ανά 100 g) χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή άνθρακα προς παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνη με χρήση του βακτηριακού στελέχους Komagateibacter sucrofermentans. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση του ελαίου με γαλακτικό αιθυλεστέρα, έναν πιο φιλικό προς το περιβάλλον διαλύτη συγκριτικά με το συμβατικά χρησιμοποιούμενο εξάνιο. Επιτεύχθηκε ανάκτηση ελαίου 35,7%, ενώ σύμφωνα με τη σύσταση των λιπαρών οξέων το έλαιο ήταν πλούσιο σε λινελαϊκό οξύ. Οι φαινολικές ενώσεις που περιέχονταν στα υπολειπόμενα στερεά εκχυλίστηκαν με αιθανόλη σε διαφορετικές αναλογίες στερεού προς διαλύτη. Έπειτα, τα υπόλοιπα στερεά αναμίχθηκαν με βόστρυχους και υποβλήθηκαν σε απολιγνινοποίηση με ΝαΟΗ, διεργασία η οποία βελτιστοποιήθηκε με χρήση πειραματικού σχεδιασμού. Η χρήση της βέλτιστης συγκέντρωσης NaOH (1,19% w/v), της θερμοκρασίας (70°C) και της διάρκειας (30 λεπτά) είχε ως αποτέλεσμα τη μέγιστη απομάκρυνση λιγνίνης (50,8%) και χαμηλές απώλειες σε ημικυτταρίνη (29,8%) και κυτταρίνη (23,6%). Το πλούσιο σε λιγνίνη και ταννίνες ρεύμα που προέκυψε από το υγρό μετά την απολιγνινοποίηση υποβλήθηκε σε ανάλυση του αριθμού Stiasny (76%), ενώ το στερεό κλάσμα υποβλήθηκε σε ενζυμική υδρόλυση για την παραγωγή ενός πλούσιου σε σάκχαρα υδρολύματος (40,3 g/L σάκχαρα). Παράλληλα, αιθανόλη, αντιοξειδωτικά και τρυγικό οξύ ανακτήθηκαν από την οινολάσπη. Η περιεχόμενη στην οινολάσπη πρωτεΐνη υδρολύθηκε ενζυμικά για να χρησιμοποιηθεί ως πηγή αζώτου σε βακτηριακές ζυμώσεις. Τα υδρολύματα που προέκυψαν συνδυάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος (SA), από το οποίο παράχθηκαν 24,9 g/L ηλεκτρικού οξέος σε ζύμωση ασυνεχούς λειτουργίας και 37,2 g/L σε ημισυνεχούς λειτουργίας ζύμωση. Τέλος, το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο καταλήγει στην παραγωγή 42,65 g βακτηριακής κυτταρίνης, 24,3 g ελαίου, 40,3 g εκχυλίσματος πλούσιου σε φαινολικά (με 1,41 δείκτη αντιοξειδωτικής ικανότητας), 40,1 g αιθανόλης, 624,8 g εκχυλίσματος ταννινών, 20,0 g τρυγικού οξέος και 157,8 g ηλεκτρικού οξέος. Σε επόμενο στάδιο αυτής της μελέτης, εύτηκτοι διαλύτες (DES) χρησιμοποιήθηκαν για την επεξεργασία στεμφύλων και βοστρύχων στα πλαίσια του βιοδιυλιστηρίου. Τέσσερα διαλύματα DES που παρήχθησαν με χρήση χλωριούχου χολίνης (ChCl) ως δέκτη δεσμού υδρογόνου και τέσσερα καρβοξυλικά οξέα ως δότες δεσμών υδρογόνου, συγκεκριμένα μυρμηκικό οξύ, οξικό οξύ, γαλακτικό οξύ (LA) και οξαλικό οξύ, αξιολογήθηκαν λαμβάνοντας υπόψιν την αποτελεσματικότητα τους στην απομάκρυνση της λιγνίνης, στην ενζυμική υδρόλυση των πολυσακχαριτών σε πεντόζες και εξόζες και τέλος στην ικανότητα ανακύκλωσης και επαναχρησιμοποίησης του διαλύτη. Η επεξεργασία με το διαλύτη ChCl:LA, (1:10 αναλογία κατά mol), στους 120°C για 1 ώρα, οδήγησε σε 40% απομάκρυνση λιγνίνης ενώ ήταν αποδοτικός για τέσσερις κύκλους επεξεργασίας. Η ενζυμική υδρόλυση των υπολειπόμενων στερεών μετά τον πρώτο κύκλο προεπεξεργασίας είχε ως αποτέλεσμα απόδοση μετατροπής γλυκάνης και ημικυτταρίνης ίση με 92,7% και 36,6%, αντίστοιχα. Το υδρόλυμα που παράχθηκε χρησιμοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα σε ασυνεχούς λειτουργίας καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα με το βακτηριακό στέλεχος Actinobacillus succinogenes και οδήγησε στην παραγωγή 36 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση 0,62 gSA/g ολικών σακχάρων και παραγωγικότητα 0,65 g/(L·h). Χρησιμοποιώντας 2 κιλά στεμφύλων και βοστρύχων, το ηλεκτρικό οξύ που θα μπορούσε να παραχθεί σε πέντε διαδοχικούς κύκλους επεξεργασίας με DES ήταν 200,8 g, 208 g, 204,9 g, 184,5 g και 94,3 g. Στο τελευταίο μέρος της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής χρησιμοποιήθηκε ψυχρό πλάσμα εκκένωσης διηλεκτρικού φραγμού (DBD) με σκοπό μια πιο αειφόρα προεπεξεργασία λιγνοκυτταρινικούχας βιομάζας, καθώς δεν απαιτείται η χρήση χημικών ουσιών, υψηλών θερμοκρασιών και πιέσεων όπως στην περίπτωση συμβατικών θερμοχημικών διεργασιών επεξεργασίας λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας. Σε αυτό το πλαίσιο, διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα της προεπεξεργασίας βοστρύχων με ψυχρό πλάσμα εκκένωσης διηλεκτρικού φραγμού με σκοπό την παραγωγή υδρολύματος ως θρεπτικό μέσο για την παραγωγή ηλεκτρικού οξέος με τον μικροοργανισμό A. succinogenes. Στα πλαίσια αυτού, αξιολογήθηκε η επίδραση διαφορετικών παραμέτρων λειτουργίας του ψυχρού DBD πλάσματος με χρήση αέρα (π.χ. μέγεθος σωματιδίων βοστρύχων, αερισμός, διάρκεια προεπεξεργασίας, κύκλος λειτουργίας, αρχική συγκέντρωση στερεών). Η προεπεξεργασία με 150 g/L βοστρύχων (<0,25 mm μέγεθος σωματιδίων) για 60 λεπτά, 20% κύκλο λειτουργίας και αερισμό 2,5 vvm οδήγησε σε απόδοση ενζυμικής υδρόλυσης γλυκάνης και ημικυτταρίνης 85,2% και 50,4%, αντίστοιχα, που ήταν δύο φορές και 3,3 φορές μεγαλύτερη από την απόδοση υδρόλυσης που επιτυγχάνεται χωρίς προεπεξεργασία του στερεού. Πρόσθετο πλεονεκτήματα της επεξεργασίας με πλάσμα αέρα DBD ήταν η επιτυχή χρήση τόσο στερεών όσο και υγρών κλασμάτων στην ενζυμική υδρόλυση και η δυνατότητα επίτευξης ταυτόχρονης προεπεξεργασίας και αποστείρωσης. Το υδρόλυμα βοστρύχων που παρήχθη χρησιμοποιήθηκε σε καλλιέργειες με το βακτηριακό στέλεχος A. succinogenes καταλήγοντας στην παραγωγή 37,1 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση 0,68 gSA/g ολικών σακχάρων και 0,65 g/(L·h) παραγωγικότητα. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν παρόμοια με αυτά που επιτεύχθηκαν μετά τη ζύμωση με χρήση εμπορικής πηγής άνθρακα αποδεικνύοντας της αποτελεσματικότητα της διεργασίας.