Μελέτη της έκφρασης και της λειτουργίας των microRNAs στον οστικό μεταβολισμό HIV θετικών ατόμων

Abstract

In the era of combined antiretroviral therapy (cART), the risk of osteoporosis and osteoporotic fractures in HIV-positive persons is increasing, and the role of small non-coding RNAs (microRNAs) is considered important. The purpose of the present study was to assess the incidence of osteopenia/osteoporosis in male HIV-positive persons on cART treatment and the gene expression of small non coding RNAs (microRNAs) targeting specific molecular pathways of bone metabolism in the study population. Patients and methods: This is a cross-sectional case control study with a 1:1 ratio, and participants were recruited from the registered patients of the First Department of Internal Medicine, of the General University Hospital AHEPA in Thessaloniki. The study was approved by the Bioethics Committee of the Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, Aristotle University of Thessaloniki (protocol number 178), and the participating patients signed an informed consent form for their participation in the study. The first subgroup (cases) consisted of 30 HIV-positive men with osteopenia/osteoporosis, T-score < -2.5 SD (SD: Standard Deviation) for osteoporosis and T-score between -1 and -2.5 SD for osteopenia, mean age 54.7 ± 8.9. The second subgroup (controls 1) consisted of 30 HIV-positive men with normal bone mass according to the WHO criteria (T-score criteria) and mean age 52.6 ± 6.0 years, with the aim of looking for differences in the expression of microRNAs. Mean duration of antiretroviral therapy 10 ± 7 years (mean duration of antiretroviral therapy ranged from 2 to 26 years). The determination of the expression profile of microRNAs was also carried out in a 2nd group (controls 2), which is made up of 30 individuals of the normal medical and other staff of P.G.N.AHEPA Thessaloniki, corresponding gender and age 54.7 ± 5.4 for a further comparison with the HIV (+) persons of the cohort study (1st and 2st subgroup). All participants underwent a complete hematological, biochemical, hormonal control as well as the recording of CD4 count measurements. Bone mineral density (BMD), bone quality (TBS) and body composition were also measured using the DXA method. Isolation of microRNAs from participants' serum was performed using specific microRNEasy kit reagents (Qiagen, Hilden, Germany) and the analysis of differentially expressed microRNAs was performed by RT-qPCR. Results: The selected panel of microRNAs targeting specific molecular pathways of bone metabolism are hsa-miRNA-21-5p, hsa-miRNA-23a-3p, hsa-miRNA-24-2-5p, hsa-miRNA-26a-5p, hsa-miRNA-29a-3p, hsa-miRNA-124-3p, hsa-miRNA-33a-5p and hsa-miRNA-133a-3p. According to the results of our cohort the expression levels of miR-24-2-5p were increased (p = 0.030), while the expression of miR-21-5p and miR-23a-3p were decreased (p < 0.001) in serum of HIV-positive men with osteoporosis compared to HIV-positive men with normal bone mass. miRNA-21-5p expression shows 84.6% sensitivity and 66.7% specificity in distinguishing between HIV-positive men with osteoporosis and those with normal bone mass. Conclusions: The present study indicates the statistically significant expression of hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p and hsa-miR-24-2-5p in the serum of HIV positive persons with osteoporosis and point out the important role of microRNAs in regulating the pathogenesis of various bone diseases, with the ultimate goal of contributing to the evolving debate in the scientific community regarding the use of microRNAs as novel biomarkers in a category of people requiring life-long treatment.

Στην εποχή της συνδυασμένης αντιρετροϊκής αγωγής (cART) αυξάνεται ο κίνδυνος της οστεοπόρωσης και των οστεοπορωτικών καταγμάτων σε HIV θετικά άτομα και σημαντικός κρίνεται ο ρόλος των μικρών μη-κωδικοποιούντων RNA (microRNAs). Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η καταγραφή της συχνότητας της οστεοπενίας/οστεοπόρωσης σε άρρενα HIV θετικά άτομα υπό αγωγή cART και η γονιδιακή έκφραση των μικρών μη – κωδικοποιούντων RNA (microRNAs), που στοχεύουν σε συγκεκριμένα μοριακά μονοπάτια του οστικού μεταβολισμού στον υπό μελέτη πληθυσμό. Ασθενείς και μέθοδοι: Πρόκειται για μία μελέτη διατομής στο χρόνο ασθενών-μαρτύρων (cross-sectional case control study) με αναλογία 1:1. Η στρατολόγηση των συμμετεχόντων πραγματοποιήθηκε από τους καταγεγραμμένους ασθενείς της Μονάδας των Ειδικών Λοιμώξεων της Ά Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ Θεσσαλονίκης. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή Βιοηθικής του τμήματος Ιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (αριθμός πρωτοκόλλου 178) και οι συμμετέχοντες ασθενείς υπέγραψαν έντυπο συγκατάθεσης για τη συμμετοχή τους στη μελέτη. Η 1η υποομάδα (ασθενείς) αποτελείται από 30 HIV θετικά άρρενα άτομα με οστεοπενία/οστεοπόρωση, T-score < −2.5 SD (SD: Standard Deviation, τυπική απόκλιση) για οστεοπόρωση και T-score μεταξύ −1 και −2.5 SD για οστεοπένια, μέση ηλικία 54.7 ± 8.9. Η 2η υποομάδα (μάρτυρες 1) αποτελείται από 30 HIV θετικά άρρενα άτομα με φυσιολογική οστική μάζα με βάση τα κριτήρια του Π.Ο.Υ. (T-score κριτήρια) και μέσος όρος ηλικίας 52.6 ± 6.0, με απώτερο σκοπό την αναζήτηση διαφορών στην έκφραση των microRNAs. Η μέση διάρκεια αντιρετροϊκής αγωγής 10 ± 7 έτη (η διάρκεια της αντιρετροϊκής αγωγής κυμαίνονταν από 2 έως 26 έτη). Ο προσδιορισμός του προφίλ της έκφρασης των microRNAs διεξήχθη επίσης σε μια 2η ομάδα (μάρτυρες 2), η οποία απαρτίζεται από 30 άτομα του φυσιολογικού ιατρικού και λοιπού προσωπικού του Π.Γ.Ν.ΑΧΕΠΑ Θεσσαλονίκης, αντιστοίχου φύλου και ηλικίας 54.7 ± 5.4 για μια περαιτέρω σύγκριση με τα HIV (+) άτομα της κοόρτης (1ης και 2ης υποομάδας). Σε όλους τους συμμετέχοντες πραγματοποιήθηκε πλήρης αιματολογικός, βιοχημικός, ορμονολογικός έλεγχος καθώς και η καταγραφή των μετρήσεων CD4. Επίσης διενεργήθηκε μέτρηση της οστικής πυκνότητας (BMD), της οστικής ποιότητας (TBS) και της σύστασης του σώματος με τη μέθοδο DXA. Η απομόνωση των microRNAs από τον ορό των συμμετεχόντων διεκπεραιώθηκε με τη χρήση ειδικών αντιδραστηρίων miRNeasy Serum/Plasma Kit της κατασκευαστικής εταιρείας Qiagen, Hilden, Germany και ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης με τη μέθοδο της RT-qPCR. Αποτελέσματα: Το επιλεγμένο πάνελ των microRNAs που στοχεύουν σε συγκεκριμένα μοριακά μονοπάτια του οστικού μεταβολισμού είναι hsa-miRNA-21-5p, hsa-miRNA-23a-3p, hsa-miRNA-24-2-5p, hsa-miRNA-26a-5p, hsa-miRNA-29a-3p, hsa-miRNA-124-3p, hsa-miRNA-33a-5p και hsa-miRNA-133a-3p. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της κοόρτης μας τα επίπεδα έκφρασης του miR-24-2-5p ήταν αυξημένα (p = 0.030), ενώ η έκφραση των miR-21-5p και miR-23a-3p ήταν μειωμένη (p < 0.001) στον ορό των HIV θετικών ατόμων με οστεοπόρωση συγκριτικά με τα HIV θετικά άτομα με φυσιολογική οστική μάζα. Η έκφραση του miRNA-21-5p εμφανίζει 84,6% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα στη διάκριση μεταξύ των HIV θετικών ατόμων με εμφάνιση οστεοπόρωσης και εκείνων με φυσιολογική οστική μάζα. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη υποδεικνύει τη στατιστικώς σημαντική έκφραση των hsa-miR-21-5p, hsa-miR-23a-3p και hsa-miR-24-2-5p στον ορό των HIV θετικών ατόμων με οστεοπόρωση και επισημαίνουν το σημαντικό ρόλο των microRNAs στη ρύθμιση της παθογένειας των διαφόρων οστικών νοσημάτων, με απώτερο στόχο να συμβάλλει στη συζήτηση που εξελίσσεται στην επιστημονική κοινότητα σχετικά με τη χρήση των microRNAs ως νέων βιοδεικτών σε μια κατηγορία ατόμων που χρειάζονται θεραπεία εφόρου ζωής.