Διερεύνηση γενετικών και άλλων παραγόντων σχετιζόμενων με την ανάπτυξη διαταραχών του λόγου σε ασθενείς με Νόσο Alzheimer και Ήπια Νοητική Διαταραχή

Abstract

Introduction: Besides memory impairment, language disorders are among the main clinical features of patients with Alzheimer's disease (AD) and Mild Cognitive Impairment (MCI). These aphasic features cause significant morbidity and disruption in everyday life activities. In addition, Primary Progressive Aphasia (PPA), a syndrome with prominent language impairment, is one of the atypical forms of AD. On the other hand, language disorders are a main feature of Frontotemporal Dementia (FTD), which differs from AD in histopathological patterns and pathophysiological mechanisms. This suggests that patients clinically diagnosed as AD could have a pathophysiological background of FTD and vice versa. Aims: The aim of this thesis was to identify and study genetic and other factors that may contribute to the development of MCI and dementia in general and aphasia in specific. This information is crucial for elucidating the pathogenesis and phenotypic expression of AD and FTD. Methods/Results: This thesis evolved on four levels: A) First, we performed analysis of the clinical phenotype of patients (n=363) with dementia (mainly AD) and MCI from the Cretan Aging Cohort (CAC) and the "SKEPSI" Cohort for the presence of language disorders. These analyses showed that about one third (31.6%) of the patients had language deficits. Furthermore, when we took into consideration only those patients with prominent language impairment in the absence of memory dysfunction, we found that 13.7% of the total patient group met the criteria for PPA. B) Next, we analyzed Whole Exome Sequencing (WES) data of patients diagnosed with AD (n=95) and MCI (n=20) and cognitively normal individuals (n= 81) from the CAC for the presence of pathogenic variants in genes related to FTD and to neurodegeneration in general. This led to the following findings:1) The identification of the p.Ile383Val change in the FTD-associated TARDBP gene in 2 CAC patients diagnosed with AD. This and 2 other pathogenic variants of the same gene were also found in 4 patients, non CAC members, with FTD and/or Motor Neuron Disease (MND).2) The detection of the possible protective role of the GLUD2 gene p.Ser498Ala variant against development of AD. Specifically, this variant was less frequent in AD patients (2.11%) than in the control group (16%, p<0.01). These results were tested in two larger cohorts, from Crete and the Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI), respectively. In both latter cohorts, although there was a similar trend with the p.Ser498Ala results in the initial CAC, it did not reach statistical significance.3) As a confirmation of the genetic validity of our CAC, we found that the APOE ε4 allele, as expected, was more frequent in AD patients (23.2%) than in controls (7.4%; p<0.01).C) Due to the emerging importance of the TDP-43 protein (encoded by the TARDBP gene) in the pathophysiology of neurodegenerative diseases, including AD, FTD, and MND, we studied its distribution in the brains of patients with AD dementia, using samples from the Cretan Brain Bank. This revealed the presence of TDP43 deposits in 90% (9/10) of patients. D) Due to the potential protective role of the hGDH2 p.Ser498Ala change (which leads to possible gain of function) in AD-related neurodegeneration, we performed experiments in HEK293 cell lines overexpressing the hGDH1 and hGDH2 enzymes. After confirming that the enzymes are co-localized at the sub-cellular level using confocal microscopy, we performed a series of preliminary experiments showing that cells overexpressing hGDH2 have increased viability. This finding is consistent with the potential neuroprotective role of the gain of function p.Ser498Ala alteration of hGDH2 in dementia. Conclusions: We demonstrate in our study that patients with a clinical diagnosis of AD could have a clinical, genetic, and pathophysiological background related to FTD, the prototype disease where language disorders appear as the main clinical feature. We also found that the TDP-43 and hGDH2 proteins play an important role in the pathophysiology of these two neurodegenerative diseases. These findings highlight the extensive phenotypic and pathophysiological overlap between AD and FTD, two of the most important forms of dementia.

Εισαγωγή: Ένα χαρακτηριστικό κλινικό εύρημα σε ασθενείς με νόσο Alzheimer (ΝΑ), την συχνότερη μορφή άνοιας, όσο και σε άτομα με Ήπια Νοητική Διαταραχή (ΗΝΔ) είναι, πέραν των διαταραχών μνήμης, οι διαταραχές λόγου. Οι δυσκολίες αυτές αποτελούν παράγοντα σημαντικής νοσηρότητας και δυσλειτουργίας στην καθημερινότητα των ασθενών. Επιπλέον, ανάμεσα στις άτυπες μορφές της ΝΑ υπάρχει και ένα σύνδρομο με προεξέχουσες διαταραχές στο λόγο, η Πρωτοπαθής Προϊούσα Αφασία (ΠΠΑ). Από την άλλη, οι διαταραχές του λόγου είναι κύρια εκδήλωση της Μετωποκροταφικής Άνοιας (ΜΚΑ), η οποία έχει διαφορετικό παθολογο-ανατομικό υπόβαθρο και παθοφυσιολογικό μηχανισμό από την ΝΑ. Αυτό υποδηλώνει ότι ασθενείς που διαγιγνώσκονται κλινικά με ΝΑ θα μπορούσαν να έχουν παθοφυσιολογικό υπόβαθρο ΜΚΑ και το αντίστροφο.ΣκοπόςΣτόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αναζήτηση και μελέτη γενετικών και άλλων παραγόντων που μπορεί να συμβάλλουν στην ανάπτυξη ΗΝΔ και άνοιας γενικότερα, αλλά και ειδικότερα αφασικών διαταραχών, ώστε να γίνει κατανοητή καλύτερα η παθογένεια και η φαινοτυπική έκφραση της ΝΑ και της ΜΚΑ.Μέθοδοι/ΑποτελέσματαH παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε σε τέσσερα επίπεδα:Α) Έγινε ανάλυση του κλινικού φαινοτύπου των ασθενών με άνοια (κυρίως ΝΑ) και ΗΝΔ (n=363) από τη Μελέτη Γήρανσης της Κρήτης (ΜΓΚ) και την αντίστοιχη Μελέτη ΣΚΕΨΗ ως προς την ύπαρξη διαταραχών λόγου. Οι αναλύσεις αυτές έδειξαν ότι ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών είχε αφασική διαταραχή (31.6%). Επιπλέον, όταν αναλύσαμε ξεχωριστά τους ασθενείς με προεξέχουσες διαταραχές λόγου αλλά όχι διαταραχές στη μνήμη, καταλήξαμε ότι το 13.7% του συνόλου των ασθενών είναι πιθανό να πληροί τα κριτήρια για ΠΠΑ.Β) Έγινε μελέτη των αποτελεσμάτων αλληλούχισης ολικού εξώματος (WES) ασθενών με διάγνωση ΝΑ (n=95) και ΗΝΔ (n=20) και νοητικά φυσιολογικών ατόμων (n= 81) από την ΜΓΚ για την παρουσία παθογόνων αλλαγών σε γονίδια που σχετίζονται με την ΜΚΑ (η οποία έχει ως μία από τις κύριες εκφράσεις της τις διαταραχές στο λόγο), αλλά και την νευροεκφύλιση γενικότερα. Αυτό οδήγησε:1) Στην ανίχνευση της αλλαγής p.Ile383Val στο (σχετιζόμενο με ΜΚΑ) γονίδιο TARDBP σε 2 ασθενείς από την ΜΓΚ με διάγνωση ΝΑ. Αυτή η αλλαγή και άλλες 2 αλλαγές στο ίδιο γονίδιο βρέθηκαν και σε 4 ασθενείς (μη μέλη της ΜΓΚ) με ΜΚΑ/Νόσο Κινητικού Νευρώνα (ΝΚΝ). 2) Στην ανάδειξη του πιθανού προστατευτικού ρόλου της p.Ser498Ala αλλαγής στο γονίδιο GLUD2 (κωδικοποιεί την hGDH2 πρωτεΐνη) ως προς την ανάπτυξη άνοιας του τύπου της ΝΑ. Συγκεκριμένα, η αλλαγή αυτή ήταν λιγότερο συχνή σε ασθενείς με ΝΑ (2,11 %) από ό,τι στην ομάδα ελέγχου (16%, p<0,01). Τα αποτελέσματα αυτά ελέγχθηκαν σε μεγαλύτερο πληθυσμό, τόσο από την Κρήτη όσο και από το Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI), και παρόλο που υπήρχε μία αντίστοιχη τάση με αυτήν της αρχικής μελέτης μας, αυτή δεν έφτασε σε στατιστική σημαντικότητα.3) Στην διαπίστωση, ως επιβεβαίωση της γενετικής εγκυρότητας του πληθυσμού μας, ότι το αλληλόμορφο APOE ε4 ήταν πιο συχνό σε ασθενείς με ΝΑ (23,2%) από ότι στην ομάδα ελέγχου (7,4%; p<0,01).Γ) Λόγω της αναδυόμενης σημασίας (από τα δικά μας αλλά και από ευρήματα άλλων ερευνητών) της TDP43 πρωτεΐνης (κωδικοποιείται από το TARDBP γονίδιο) στην παθοφυσιολογία πολλών νευροεκφυλιστικών νοσημάτων, συμπεριλαμβανομένης και της ΝΑ, της ΜΚΑ και της ΝΚΝ μελετήσαμε την έκφρασή της σε εγκεφάλους ασθενών με άνοια, του τύπου της ΝΑ, από την Κρητική Τράπεζα Εγκεφάλων. Αυτό ανέδειξε την παρουσία εναποθέσεων της TDP43 στο 90% (9/10) των ασθενών.Δ) Λόγω του πιθανού προστατευτικού ρόλου της p.Ser498Ala αλλαγής της hGDH2 (η οποία οδηγεί σε gain of function) στην νευροεκφύλιση που σχετίζεται με την άνοια, πραγματοποιήσαμε πειράματα σε κυτταρικές σειρές HEK293 οι οποίες υπερεκφράζουν τα ένζυμα hGDH1 και hGDH2. Αφού επιβεβαιώθηκε ότι τα ένζυμα συνεντοπίζονται υποκυτταρικά με τη χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας, πραγματοποιήθηκε μια σειρά προκαταρκτικών πειραμάτων που έδειξαν ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την hGDH2 έχουν αυξημένη βιωσιμότητα. Αυτό το εύρημα είναι συμβατό με τον πιθανό νευροπροστατευτικό ρόλο της gain of function p.Ser498Ala αλλαγής της hGDH2 στην άνοια. ΣυμπέρασματαΑναδείξαμε στην μελέτη μας ότι ασθενείς με κλινική διάγνωση ΝΑ θα μπορούσαν να έχουν ένα κλινικό, γενετικό και παθοφυσιολογικό υπόβαθρο που να σχετίζεται με ΜΚΑ, την προεξάρχουσα νόσο όπου εμφανίζεται, ως κύριο χαρακτηριστικό, διαταραχή του λόγου. Επίσης, βρήκαμε ότι σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία των δύο αυτών νευροεκφυλιστικών αυτών νοσημάτων παίζουν οι πρωτεΐνες TDP43 και hGDH2. Αυτά τα ευρήματα αναδεικνύουν την μεγάλη φαινοτυπική και παθοφυσιολογική αλληλεπικάλυψη μεταξύ των νόσων που προκαλούν άνοια.