Μεταβολομική ανάλυση αίματος και ούρων στη νεογνική σήψη και νεκρωτική εντεροκολίτιδα

Abstract

Late-onset sepsis (LOS) and necrotizing enterocolitis (NEC) are major causes of neonatal morbidity and mortality, while early diagnosis is critical. However, current biomarkers lack of high diagnostic accuracy in early diagnosis. Metabolomics is an analytical method for the detection of reliable biomarkers. In this prospective, case-control study, we determined the metabolic profile of neonates with LOS and NEC. Urine and blood samples were collected on the day of the initial evaluation for suspected sepsis / NEC and on the 3rd and 10th day thereafter, from neonates with possible and confirmed LOS and neonates with suspected and confirmed NEC, as well as from matched neonates without sepsis or NEC (controls) at the respective time points. Urine metabolic profiles were assessed using non-targeted nuclear magnetic resonance spectroscopy (H-NMR) and targeted liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis (LC-MS/MS). Blood metabolic profiles were assessed using liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight-mass spectrometry (LC-QTOF-MS).Urine analysis in LOS identified seventeen metabolites, involved in different metabolic pathways, mainly related to the increased energy demands of the cell in sepsis, disturbed cell metabolism and cell destruction. Multivariate statistical models with data from either analytical approach showed clear separation between the metabolic profiles of septic neonates (both possible and confirmed) and the controls. Metabolic changes were related to the disease progression. Neonates with confirmed or possible LOS exhibited comparable metabolic profiles indicating similar metabolic alternations upon the onset of clinical manifestations. Neonates with LOS were discriminated from non-septic individuals, providing potential for future discovery of LOS-related biomarkers.Urine analysis in NEC using metabolomics, showed clear separation between the metabolic profiles of neonates with NEC and controls. Twenty-five metabolites were identified belonging to amino and organic acids, sugars and vitamins. Several metabolite combinations had an excellent diagnostic performance in detecting neonates developing NEC and could be used as early biomarkers. Alike LOS, the metabolic profile of neonates with NEC differed significantly from that of the controls, making possible their separation. The small set of significant metabolites detected in this study could be used as early diagnostic biomarkers of NEC, if our results were validated in larger studies.Metabolomic analysis of blood samples revealed significant differences in the metabolic profile of neonates with LOS or NEC compared to their respective controls. Both in LOS and NEC, the metabolites identified belonged to organic acids and were subcategories and derivatives of phosphplipids. Additionally, L-carnitine, which is an amino acid important for energy production via beta-oxidation, could efficiently discriminate between NEC and non-NEC neonates. In neonates with LOS significant difference was observed in twelve metabolites. Five of them were identified as organic acids and two were peptides. In neonates with NEC, significant differences were observed in seventeen metabolites. Five were identified as organic acids and one as L-carnitine. The results of the current study suggest that phosphatidylocholines and lysophosphatidylocholines could be used as biomarkers for early detection of neonatal sepsis and NEC and follow up of the disease course, monitoring the response to therapy and potentially predicting the outcome. However, these results should be validated in larger studies.

Η όψιμη σήψη (σήψη) και νεκρωτική εντεροκολίτιδα (ΝΕΚ) αποτελούν μείζονες αιτίες νεογνικής νοσηρότητας και θνησιμότητας, ενώ η έγκαιρη διάγνωση είναι κριτικής σημασίας. Ωστόσο, η ακρίβεια των υπαρχόντων βιοδεικτών υπολείπεται ως προς την έγκαιρη διάγνωση. Η μεταβολομική ανάλυση είναι μία μέθοδος για την εύρεση αξιόπιστων βιοδεικτών. Σε αυτή την προοπτική μελέτη ασθενών-μαρτύρων, διερευνήσαμε το μεταβολικό προφίλ ούρων και αίματος σε νεογνά με σήψη και ΝΕΚ. Δείγματα ούρων και αίματος συλλέχθηκαν την ημέρα της αρχικής εκτίμησης της νόσου, καθώς και την 3η και 10η ημέρα μετά, από νεογνά με επιβεβαιωμένη ή πιθανή σήψη και από νεογνά με επιβεβαιωμένη ή ύποπτη ΝΕΚ, καθώς και από νεογνά χωρίς σήψη/ΝΕΚ (μάρτυρες), στις αντίστοιχες χρονικές στιγμές. Το μεταβολικό προφίλ των ούρων αξιολογήθηκε με τη χρήση φασματοσκοπικής απεικόνισης μη-στοχευμένου πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού πρωτονίων (H-NMR) και στοχευμένης φασματοσκοπικής ανάλυσης υγρής συζευγμένης χρωματογραφίας μαζών (LC-MS/MS). Το μεταβολικό προφίλ του αίματος αξιολογήθηκε με την τεχνική υγρής χρωματογραφίας-τετραπολικού αναλυτή χρόνου πτήσης φασματομετρίας μαζών (LC-QTOF-MS). Από την ανάλυση των ούρων στην σήψη, ταυτοποιήθηκαν δεκαεπτά μεταβολίτες, οι οποίοι συμμετέχουν σε διάφορες μεταβολικές οδούς που σχετίζονται κυρίως με τις αυξημένες ενεργειακές ανάγκες του κυττάρου στη σήψη, τη διαταραχή του κυτταρικού μεταβολισμού και την καταστροφή των κυττάρων. Η πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση και με τις δύο αναλυτικές μεθόδους έδειξε σαφή διαχωρισμό στο μεταβολικό προφίλ των σηπτικών νεογνών (πιθανών και επιβεβαιωμένων) και των μαρτύρων. Οι μεταβολικές αλλαγές φάνηκε να συσχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου. Τα νεογνά με επιβεβαιωμένη ή πιθανή σήψη παρουσίασαν συγκρίσιμα μεταβολικά προφίλ υποδεικνύοντας παρόμοιες μεταβολικές αλλαγές κατά την εμφάνιση των κλινικών εκδηλώσεων. Σηπτικά και μη σηπτικά νεογνά διαχωρίστηκαν, καθιστώντας πιθανή την μελλοντική ανεύρεση σχετικών βιοδεικτών.Η μεταβολομική ανάλυση των ούρων στη ΝΕΚ διαχώρισε σαφώς τα προφίλ των νεογνών με ΝΕΚ και των μαρτύρων. Ταυτοποιήθηκαν εικοσιπέντε μεταβολίτες, που ανήκουν στα αμινοξέα, στα οργανικά οξέα, στα σάκχαρα και στις βιταμίνες. Κάποιοι συνδυασμοί αυτών των μεταβολιτών διαθέτουν εξαιρετική προγνωστική αξία στην ανίχνευση νεογνών με εξελισσόμενη ΝΕΚ και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως πρώιμοι διαγνωστικοί βιοδείκτες. Το μεταβολικό προφίλ των νεογνών με ΝΕΚ διέφερε σημαντικά από τους μάρτυρες, καθιστώντας εφικτό τον διαχωρισμό τους. Επίσης, συνδυασμός ορισμένων μεταβολιτών που ανιχνεύθηκαν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως πρώιμος διαγνωστικός βιοδείκτης στην ΝΕΚ, εφόσον τα αποτελέσματά μας επικυρωθούν σε μεγαλύτερες μελέτες.Η μεταβολομική ανάλυση στα δείγματα αίματος έδειξε σημαντικές διαφορές στο μεταβολικό προφίλ των νεογνών με σήψη ή ΝΕΚ συγκριτικά με τους μάρτυρες. Τόσο στην σήψη όσο και στη ΝΕΚ, οι μεταβολίτες που ταυτοποιήθηκαν ανήκουν στα οργανικά οξέα και αποτελούν υποκατηγορίες και παράγωγα των φωσφολιπιδίων. Επιπλέον, η L-καρνιτίνη, που είναι ένα αμινοξύ σημαντικό για την παραγωγή ενέργειας μέσω της β οξείδωσης, διαχώρισε επιτυχώς τα νεογνά με και χωρίς ΝΕΚ.Στα νεογνά με σήψη παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά σε δώδεκα μεταβολίτες. Πέντε ταυτοποιήθηκαν ως οργανικά οξέα και δύο ως πεπτίδια. Στα νεογνά με ΝΕΚ παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά σε δεκαεπτά μεταβολίτες. Από αυτούς ταυτοποιήθηκαν πέντε οργανικά οξέα και η L-καρνιτίνη. Από την παρούσα μελέτη προκύπτει ότι οι φωσφατιδυλοχολίνες και οι λυσοφωσφατιδυλοχολίνες θα μπορούσαν να αποτελέσουν πρώιμους διαγνωστικούς και προγνωστικούς βιοδείκτες στη νεογνική σήψη και ΝΕΚ, εφόσον τα αποτελέσματα αυτά επικυρωθούν με μεγαλύτερες μελέτες.