Σύγχρονες μέθοδοι ολοκληρωμένης διαχείρισης αφλατοξινών στην καλλιέργεια του κελυφωτού φυστικιού

Abstract

Aflatoxins (B1, B2, G1, G2) are mycotoxins mainly produced as products of the secondary metabolism of Aspergillus section Flavi fungi. These fungi are found in nature as saprophytes, as well as parasites, therefore they are detected in a wide range of plant and animal products both at pre-harvest and post-harvest level. They have the ability to colonize a variety of substrates and their management is not a simple issue, due to their stability. They have a strong carcinogenic, mutagenic, genotoxic, and teratogenic effect, causing chronic or acute toxicity to humans and mammals.Pistachios, that are considered to be one of the most delicious and nutritious nuts, are often contaminated by toxigenic Aspergillus section Flavi strains, which produce aflatoxins. Aflatoxin contamination is one of the most important causes of qualitative and quantitative degradation of pistachios around the world. Consequently, in Europe the current legislation has set a maximum limit of 12 μg/kg of aflatoxin B1 and 15 μg/kg of total aflatoxins in pistachio nuts that are destined to be subjected to physical processing before human consumption.In the current study, an investigation was conducted aiming to find suitable endemic non-toxigenic A. flavus isolates, epiphytic yeasts and bacteria, in order to be used as biocontrol agents for aflatoxin contamination management in pistachio nuts cultivation. Initially, 1010 Aspergillus section Flavi strains were isolated from pistachio fruits from 40 pistachio orchards in Aegina Island and Fthiotida during the period 2014-2017. Their toxigenic ability and the population variation of the toxigenic isolates were studied, with the percentage of toxigenic strains varying between 42% and 89%, depending on the year and the region. Additionally, 204 isolates were subjected to Vegetive Compatibility Groups analysis (VCGs) in order to find genetically stable non-toxigenic isolates, suitable to serve as biological agents against aflatoxin contamination. A total of 56 distinct VCGs were identified in Greece, with the main non-toxic group being endemic also in Italy. This group contains the fungus used as active ingredient in AF-X1®, an already commercially launched biocontrol agent in Italy against aflatoxin contamination of maize. In vitro and in situ experiments were performed aiming to find non-toxigenic isolates able to reduce aflatoxin production, resulting in finding isolates with 100% inhibition ability. Finally, two isolates were selected for application in small-scale field experiments in pistachio orchards in Aegina Island, during the two-year period 2017-2018. The results indicated that the inhibition of aflatoxin production ranged from 76,7% to 99,9%.Moreover, 292 endemic epiphytic yeasts and 629 bacterial strains (with 161 being further evaluated) were isolated from pistachio orchards in Aegina Island during the period 2014-2015, and their ability to inhibit the growth and in vitro aflatoxin production was assessed. The most effective isolates were also evaluated in in situ experiments, where 7 yeast isolates and 1 bacterial strain were found to be able to completely inhibit aflatoxin production. This was followed by a study of the effect of the 7 yeast isolates on the expression of the transcriptional factor AflR, which is a positive regulator of aflatoxin biosynthesis of A. flavus, with results indicating a possible positive correlation of yeasts’ applications and the expression of AflR. Moreover, the sensitivity of the 7 effective yeasts to chemical fungicides (Octave®, Geoxe®, Chorus®, Scala®, Fungazil®, Opera New®) was assessed. Almost all yeasts appeared to be very sensitive to the chemicals applied. Finally, two yeast isolates and one bacterial isolate were selected for application in small-scale field experiments in 3 pistachio orchards in Aegina during 2017 and 2018 and evaluation regarding their ability to inhibit aflatoxin production, with results indicating a 100% reduction of aflatoxin production. Additionally, 20 chemical active substances of different chemical groups (SDHIs, QoIs, anilopyrimidines, DMIs, triazoles, imidazoles, phenylpyrrole, guanidines, dicarboximides, chloronitriles, benzimidazoles, dithiocarbamates and dinitro-anilines) were investigated, regarding their ability to inhibit the in vitro mycelial growth of 10 highly toxigenic A. flavus endemic strains. Pyrimethanil, cyprodinil, fludioxonil, prochloraz and imazalil were the most effective active substances. This was followed by the evaluation of 23 commercial fungicides regarding their ability to reduce in situ aflatoxin production. The inhibition of aflatoxin production by certain fungicides reached 100%. Finally, the 3 most effective commercial products (Switch®, Octave® and Scala®) were evaluated in 3 pistachio orchards in Aegina, against aflatoxin production during a two-year period (2017 and 2018), where again the inhibition reached 100%.Afterwards, a mechanistic model (AFLA-pistachio) was developed in order to predict aflatoxin contamination of pistachio nuts, based on meteorological data and previous aflatoxin contamination data at pre-harvest level. The model was based on the AFLA-maize model, which was created for maize cultivation. The internal calibration of AFLA-pistachio showed that 72,1% of the predictions were correct. In the external calibration, 95,6% of the samples were correctly predicted by the model.Finally, an electrochemical immunosensor was developed for the detection of aflatoxin B1 in pistachio nuts, by immobilizing aflatoxin B1 monoclonal antibodies on printed gold electrodes. Impedance was used to quantify aflatoxin B1. The limit of aflatoxin B1 detection for standard solutions and pistachio samples was 0,5 ng/mL and 1 ng/mL, respectively. The immunosensor was able to successfully determine aflatoxin B1 concentrations in the range 4,56-50,86 ng/mL in pistachio samples. Subsequent chromatographic analysis revealed that the immunosensor’s upper detection limit was 345 ng/mL of aflatoxin B1. Studies of selectivity for ochratoxin A and aflatoxin M1 indicated that the proposed immunosensor for the detection of aflatoxin B1 was able to differentiate between other mycotoxins produced by fungi of Aspergillus genus.In conclusion, the aforementioned research constitutes a promising proposal for a modern integrated system for aflatoxin management in pistachio nut cultivation.

Οι αφλατοξίνες (Β1, B2, G1, G2) είναι μία κατηγορία μυκοτοξινών οι οποίες παράγονται κυρίως ως προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των μυκήτων Aspergillus section Flavi. Οι μύκητες αυτοί εντοπίζονται στη φύση ως σαπροφυτικοί αλλά και ως παρασιτικοί, ως εκ τούτου ανιχνεύονται σε μεγάλο εύρος φυτικών και ζωικών προϊόντων, τόσο προσυλλεκτικά όσο και μετασυλλεκτικά. Έχουν τη δυνατότητα να αναπτύσσονται σε πληθώρα υποστρωμάτων και η διαχείρισή τους δεν αποτελεί απλό διακύβευμα λόγω της σταθερότητάς τους. Παρουσιάζουν έντονη καρκινογόνο, μεταλλαξιογόνο, γονοτοξική, και τερατογόνο δράση προκαλώντας χρόνια ή οξεία τοξικότητα στον άνθρωπο και τα θηλαστικά. Τα κελυφωτά φιστίκια, που θεωρούνται ένας από τους πιο εύγευστους και διατροφικά άριστους ξηρούς καρπούς, μολύνονται συχνά από τοξικογόνα στελέχη Aspergillus section Flavi τα οποία παράγουν αφλατοξίνες. Η μόλυνση από αφλατοξίνες αποτελεί μία από τις σημαντικότερες αιτίες ποιοτικής και ποσοτικής υποβάθμισης των κελυφωτών φιστικιών παγκοσμίως. Κατά συνέπεια, στην Ευρώπη η ισχύουσα νομοθεσία έχει ορίσει ως ανώτατο επιτρεπτό όριο τα 12 μg/kg αφλατοξίνης Β1 και τα 15 μg/kg για το σύνολο των αφλατοξινών στα κελυφωτά φιστίκια που υφίστανται φυσική επεξεργασία και προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση.Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε αρχικά, διερεύνηση για την εύρεση κατάλληλων μη τοξικογόνων απομονώσεων A. flavus, ενδημικών επιφυτικών ζυμών και βακτηρίων, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως βιολογικοί παράγοντες διαχείρισης των αφλατοξινών στην καλλιέργεια των κελυφωτών φιστικιών. Απομονώθηκαν 1010 στελέχη μυκήτων Aspergillus section Flavi από καρπούς φιστικιών από 40 φιστικεώνες στην Αίγινα και στην Φθιώτιδα κατά το διάστημα 2014-2017. Μελετήθηκε η τοξικογόνος ικανότητά τους και η πληθυσμιακή διακύμανση των τοξικογόνων απομονώσεων, η οποία κυμάνθηκε από 42% ως 89% αναλόγως του έτους και της περιοχής. Επιπρόσθετα, 204 απομονώσεις κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες βλαστικής συμβατότητας (VCGs) με σκοπό την εύρεση κατάλληλων, γενετικά σταθερών, μη τοξικογόνων απομονώσεων για τη βιολογική διαχείριση των αφλατοξινών. Εντοπίστηκαν συνολικά 56 διακριτές ομάδες στην Ελλάδα, και η επικρατέστερη μη τοξικογόνος ομάδα μεταξύ αυτών, είναι ενδημική και στην Ιταλία και σε αυτήν ανήκει και ο μύκητας που περιέχεται στο AF-X1®, ένα ήδη εγκεκριμένο βιολογικό σκεύασμα στην Ιταλία για τη διαχείριση των αφλατοξινών στην καλλιέργεια του αραβοσίτου. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν in vitro και in situ πειράματα για την εύρεση μη τοξικογόνων απομονώσεων με ικανότητα να παρεμποδίζουν την ικανότητα παραγωγής αφλατοξινών τοξικογόνων στελεχών, από όπου προέκυψαν απομονώσεις με ικανότητα 100% παρεμπόδισης. Τέλος, έγινε επιλογή δύο κατάλληλων απομονώσεων οι οποίες εφαρμόστηκαν σε πειράματα μικρής κλίμακας αγρού σε φιστικεώνες στην Αίγινα κατά τη διετία 2017-2018. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η παρεμπόδιση στη παραγωγή αφλατοξινών κυμάνθηκε από 76,7% έως 99,9%. Επιπλέον, απομονώθηκαν 292 ενδημικές επιφυτικές απομονώσεις ζυμών και 629 βακτηριακές απομονώσεις (με τις 161 να αξιολογούνται περαιτέρω), από καρπούς κελυφωτού φιστικιού από αγρούς στην Αίγινα (2014-2015) και αξιολογήθηκε η ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την ανάπτυξη και την in vitro παραγωγή αφλατοξινών. Οι πιο αποτελεσματικότερες απομονώσεις αξιολογήθηκαν σε in situ πειράματα και βρέθηκε ότι 7 απομονώσεις ζυμών και 1 βακτηριακή απομόνωση μπορούσαν να παρεμποδίσουν πλήρως την παραγωγή αφλατοξινών. Ακολούθησε μελέτη της επίδρασης των 7 αποτελεσματικών απομονώσεων ζυμών στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα AflR, που αποτελεί θετικό ρυθμιστή στη βιοσύνθεση των αφλατοξινών του A. flavus και παρατηρήθηκε πιθανή θετική συσχέτιση της εφαρμογής των ζυμών με την έκφραση του AflR. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ευαισθησία των αποτελεσματικών ζυμών σε χημικά μυκητοκτόνα σκευάσματα (Octave®, Geoxe®, Chorus®, Scala®, Fungazil®, Opera Νew®). Σχεδόν όλες οι ζύμες έδειξαν να είναι πολύ ευαίσθητες στα χημικά σκευάσματα που ελέγχθηκαν. Tέλος, επιλέχθηκαν δύο απομονώσεις ζυμών και μία βακτηριακή απομόνωση και αξιολογήθηκαν σε πειράματα μικρής κλίμακας αγρού σε 3 φιστικεώνες στην Αίγινα το 2017 και το 2018, ως προς την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την παραγωγή αφλατοξινών, με τα αποτελέσματα να υποδεικνύουν μείωση των παραγόμενων αφλατοξινών ως και 100%.Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η in vitro επίδραση 20 μυκητοκτόνων δραστικών ουσιών διαφόρων χημικών ομάδων (SDHIs, QoIs, ανιλοπυριμιδινών, DMIs, τριαζολών, ιμιδαζολών, φαινυλοπυρρολικών, γουανιδινών, δικαρβοξιμιδικών, χλωρονιτρικών, βενζιμιδαζολικών, διθειοκαρβαμικών και δίνιτρο-ανιλινών) ως προς την ικανότητα παρεμπόδισης την μυκηλιακής ανάπτυξης 10 ισχυρά τοξικογόνων ενδημικών στελεχών A. flavus. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι δραστικές ουσίες pyrimethanil, cyprodinil, fludioxonil, prochloraz και imazalil ήταν αποτελεσματικές. Ακολούθησε αξιολόγηση 23 εμπορικών χημικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων ως προς την in situ ικανότητα μείωσης των παραγόμενων αφλατοξινών. Η παρεμπόδιση στην παραγωγή από ορισμένα σκευάσματα αφλατοξινών έφτασε το 100%. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση 3 εμπορικών σκευασμάτων εκ των πιο αποτελεσματικών (Switch®, Octave® και Scala®), σε 3 φιστικεώνες στην Αίγινα, κατά των παραγόμενων αφλατοξινών του μύκητα Aspergillus flavus σε σειρά δύο ετών (2017 και 2018), όπου ξανά η παρεμπόδιση έφθασε το 100%.Ακολούθως, αναπτύχθηκε ένα μηχανιστικό μοντέλο (AFLA-pistachio) με βάση τα μετεωρολογικά δεδομένα και τις προγενέστερες μολύνσεις από αφλατοξίνες σε φιστικεώνες, προκειμένου να προβλεφθεί η ανάπτυξη του Aspergillus flavus και η μόλυνση των φιστικιών με αφλατοξίνη Β1 σε προσυλλεκτικό επίπεδο. Το μοντέλο βασίστηκε στο μοντέλο AFLA-maize, που έχει δημιουργηθεί αντίστοιχα για την καλλιέργεια του αραβοσίτου, και η εσωτερική βαθμονόμηση έδειξε ότι το 72,1% των προβλέψεων ήταν σωστές. Στην εξωτερική βαθμονόμηση, το 95,6% των δειγμάτων προβλέφθηκαν σωστά από το μοντέλο.Τέλος, αναπτύχθηκε ένας ηλεκτροχημικός ανοσοαισθητήρας για τον προσδιορισμό της αφλατοξίνης Β1 σε κελυφωτά φιστίκια, με ακινητοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων αφλατοξίνης Β1 σε εκτυπωμένα ηλεκτρόδια χρυσού με χρήση τεχνολογίας σύνθετης εμπέδησης. Το όριο ανίχνευσης αφλατοξίνης Β1 για πρότυπα διαλύματα και τα δείγματα φιστικιού ήταν 0,5 ng/mL και 1 ng/mL, αντίστοιχα. Ο ανοσοαισθητήρας μπόρεσε να προσδιορίσει επιτυχώς τις συγκεντρώσεις αφλατοξίνης Β1 στο εύρος 4,56-50,86 ng/mL σε δείγματα φιστικιών. Η χρωματογραφική ανάλυση που ακολούθησε, αποκάλυψε ότι τα ανώτατα όρια ανίχνευσης του ανοσοαισθητήρα ήταν σε συγκεντρώσεις αφλατοξίνης Β1 χαμηλότερες από 345 ng/mL. Μελέτες εκλεκτικότητας έναντι της ωχρατοξίνης Α και της αφλατοξίνης Μ1 έδειξαν ότι ο προτεινόμενος ανοσοαισθητήρας για την ανίχνευση της αφλατοξίνης Β1, μπόρεσε να κάνει διάκριση μεταξύ των διαφόρων μυκοτοξινών που παράγονται από μύκητες του γένους Aspergillus. Συμπερασματικά, οι προαναφερθείσες ερευνητικές ενότητες αποτελούν μία υποσχόμενη πρόταση ενός σύγχρονου ολοκληρωμένου συστήματος διαχείρισης αφλατοξινών στη καλλιέργεια του κελυφωτού φιστικιού.