Τοξικοπαθολογικές αλλοιώσεις ως δείκτες τοξίκωσης ψαριών από βαρέα μέταλλα και η επίδρασή τους κατά την εκκόλαψη και οργανογένεση των εμβρύων

Abstract

Introduction: Heavy metals become highly toxic when they are present in higher concentrations. Metals gain access into the ecosystem through multifarious sources like effluents from industries, agricultural runoff and untreated sewage and the removal of heavy metals completely upon gaining entrance into the environment becomes difficult. Water contamination by heavy metals may pose adverse effects on the ecological balance of natural water bodies, including loss of aquatic diversity. Metal contamination in aquatic ecosystem is considered to be unsafe not only for the aquatic lives but also for the human beings. Aim: The current study looks at acute toxicity and sub-lethal heavy metals toxicity on developing adults zebrafish as well as on developing zebrafish embryos up to 96 hours post fertilization (PSF). More specifically: a) The purpose of 1st research desing was the investigate of the impact of the heavy metals Copper (Cu), Zinc (Zn), Iron (Fe), Cobalt (Co), Chromium (Cr), Aluminum (Al), Manganese (Mn) and Molybdenum (Mo) on physical parameters' of the adults zebrafish and b) The purpose of 2st research desing was the investigate of the impact the impact of heavy metals, such as Copper, Zinc, Iron, Cobalt, Chromium, Aluminum, Manganese, Molybdenum on zebrafish eggs hatching rate and the subsequent survival of the larvae. Method: The current project carried were carried out the experiments between April 2016 and January 2019 at the Department of Agriculture, University of Ioannina, under the supervision of the Department of Veterinary Medicine of the University of Thessaly. In the first study for each one metal, samples of 40 fishes were exposed to solutions of 1mg/kg/day for the first month and 5mg/kg/day for the second and the third months in order to detect the physical dysfunctions that would occur due to the environment toxicity. The samples were examined for alteration in tissue burden in gill, intestines, muscles, liver, kidney and brain. The observations were made every month up to 3 months where the experiment completed. The impact of the heavy metals on physical parameters of zebrafish were investigated using beta regression and binary logistic regression. In the second study, we allocated four-hour PSF zebrafish embryos in four groups with duplicates, and 500 mg, 50 mg, and 0,05 mg/l and a control group for 96 hours PSF. At each location, a Corning® plate (24-well) was initially placed with the proposed concentrations of heavy metals, and then 15 fertilized eggs were placed in each plate as well. Subsequently, observable changes were recorded during the hatching and organogenesis. The duration of heavy metals exposure in fertilized zebrafish eggs was 96h, extended by 24h longer -the standard required time to absorb the yolk-sac. In the first 48 hours, observations and recordings took place every 6 hours, while in the next 48 hours they took place every 12 hours under the observation of an electron microscope and a stereoscope with a built-in camera. Three larvae were selected randomly for the heart rate measurement for each experimental group for repeated measurements. The heart rate measurement was performed 6 hours after hatching for each experimental group. The Cox regression, the non-parametric log-ranking test and the analysis of variance was performed using the SPSS v. 21, while the proportional hazards assumption, the computation of the power of the Cox and the shared Frailty model was implemented with R statistical language equipped with “frailtypack” and “powerSurvEpi” packages. Finally, the package “rpart” of the R language was used to implement the classification tree. Results: 1) The first study’s results showed that Copper, Aluminum and Chromium emerged as a group of metals having larger toxic effect on Gills among the 8 examined metals, whereas a significant time effect was also reported for specific Gills pathogenies. On the other hand Iron and Chromium were identified as metals having larger toxic effect on Liver and Kidney than the control group, having in particular significantly larger possibility to cause interstitial degeneration and tubular degeneration. Also, showed: a) pathological symptoms on gills of zebrafish (oedema at the tip of the secondary lamellae, gill epithelial hyperplasia of secondary lamellae, breakdown of pillar cells on early telangiectatic processes of secondary lamellae, curling of secondary lamellae and telangiectasia on full lamellae length. Note the “spindle” cell morphology of the erythrocytes within secondary lamellae. Note the lifting of secondary lamellae epithelium on the oedematic area containing flocculent eosinophilic material within it). b) pathological symptoms on muscles of zebrafish (early infiltration of macrophages on degenerative muscle fibers exhibiting severe fragmentation and vacuolation, severe necrotizing myositis associated with toxicity, enlarged (swollen) hyper-eosinophilic muscle fibers (Hya) with loss of cross striations, acute segmental myofiber necrosis, complete tear (rupture) of a muscle fiber). c) pathological symptoms on intestine of zebrafish (mild atrophy of intestinal villi, obvious minor to moderate villous blunting (decreased villous height), erosion and ulcers on distal ends of villi, severe ulcerative enteropathy, submucosal hemorrhage of intestine with ulcerative enteropathy, cellular inflammation of intestine, focal hyperplasia of intestine, smaller and more basophilic hyperplastic cells than normal mucosa). 2) The second study’s results showed significant differences in the hatching and survival rate of larvae between the control group and in most of the experimental groups when adding heavy metals in various concentrations. The highest concentration (500 mg/l) of the induced heavy metals tested in the current study resulted in total egg or larvae mortality within 96 hours and significantly lower egg or larvae life expectancy. The most significant impact on hatching time among the tested metals was Zinc and Molybdenum, in contrast to iron that did not differentiate results from the control group. Copper, Cobalt, Chromium, Aluminum and Manganese affected zebrafish eggs differentiated results and was concentration-depended. Also, the study’s findings demonstrated a significant dependence of the hatched eggs heart rate on the metal concentration, and in particular, higher concentrations of metals correspond to higher heart rate. Zinc, Molybdenum and Copper proved the most toxic heavy metals causing increased hazard rate to mortality up to 96 hours and shorter life expectancy. Finally, skeletal deformities that occasionally observed did not significantly affect the total life expectancy of hatched eggs. Conclusions: Based on the results obtained, it is observed that prolonged exposures of zebrafish in heavy metal solutions can cause pathological changes in various organs. Also, the results underline the impact of the heavy metals (Copper, Zinc, Iron, Cobalt, Chromium, Aluminum, Manganese, Molybdenum) on the hatching rate of eggs of the zebrafish, survival of the larvae as well as and heart rate. Thus, the importance of quantification and removal of metals from the different water bodies is emphasized, aiming to mitigate the effects of these substances to aquatic life and subsequently to human health. These results indicate the toxic effects of heavy metals on embryonic development of zebrafish and suggest the need for further experiments to clarify the different mechanisms underlying such alterations. The findings of the present study indicate that preventing the entry of heavy metals in the aquatic environment seems to be an essential priority for the future.

Εισαγωγή: Τα βαρέα μέταλλα καθίστανται εξαιρετικά τοξικά όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις και αποκτούν συνήθως πρόσβαση στο οικοσύστημα μέσω πολλών διαφορετικών πηγών όπως απόβλητα από βιομηχανίες, απορροή γεωργικών προϊόντων, ακατέργαστα λύματα και η απομάκρυνσή τους από το περιβάλλον είναι ιδιαίτερα δύσκολη. Η μόλυνση του νερού από βαρέα μέταλλα μπορεί να έχει δυσμενείς επιπτώσεις στην οικολογική ισορροπία, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας της υδάτινης ποικιλομορφίας, και δεν θεωρείται ασφαλής όχι μόνο για τους υδρόβιους οργανισμούς αλλά και για τους ανθρώπους. Σκοπός: Η παρούσα διατριβή εξετάζει την τοξικότητα των βαρέων μετάλλων σε ενήλικα άτομα zebrafish, καθώς και στην ανάπτυξη των εμβρύων έως και στις 96 ώρες μετά τη γονιμοποίηση. Πιο συγκεκριμένα: α) Ο σκοπός της 1ης ερευνητικής ενότητας ήταν η εκτίμηση του παθολογικού αποτυπώματος που προκαλούν τα βαρέα μέταλλα (Χαλκός, Ψευδάργυρος, Σίδηρος, Κοβάλτιο, Χρώμιο, Αλουμίνιο, Μαγγάνιο και Μολυβδαίνιο) μετά από μακρά χορήγησή τους σε ενήλικα ψάρια zebrafish μέσω της τροφής, και β) Ο σκοπός της 2ης ερευνητικής ενότητας ήταν η διερεύνηση των τοξικοπαθολογικών μεταβολών στα έμβρυα zebrafish από βαρέα μέταλλα μέσω του νερού διαβίωσης. Μέθοδος: Η πειραματική μελέτη πραγματοποιήθηκε από τον Απρίλιο 2016 έως και τον Ιανουάριο 2019, στο Εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών του Τμήματος Γεωπονίας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων υπό την εποπτεία του Τμήματος Κτηνιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. α) Στην πρώτη μελέτη, δείγματα 40 ενήλικων zebrafish εκτέθηκαν σε κάθε ένα από τα 8 μέταλλα. Η συγκέντρωση χορήγησης για κάθε βαρύ μέταλλο αυξανόταν σταδιακά, τον πρώτο μήνα σε 1mg/kg/ημέρα, το δεύτερο μήνα σε 5mg/kg/ημέρα και τον τρίτο μήνα παρέμενε ίδια, 5mg/kg/ημέρα. Η εφαρμογή του κάθε βαρέος μετάλλου ανά ομάδα zebrafish πραγματοποιήθηκε για 3 μήνες όσο περίπου απαιτείται για την ωρίμανση των γονάδων στο συγκεκριμένο είδος. Οι δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν σε τρεις χρονικές περιόδους, μία δειγματοληψία για κάθε μήνα. Καθ’ όλη τη διάρκεια της χορήγησης των βαρέων μετάλλων γινόταν καταγραφή των φυσικοχημικών παραμέτρων, της θνησιμότητας, και γενικά οποιασδήποτε μη φυσιολογικής συμπεριφοράς των ψαριών και του περιβάλλοντος. Για κάθε βαρύ μέταλλο ελέγχθηκαν ξεχωριστά η βιοσυσσώρευση, οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις, οι βασικές αιματολογικές παράμετροι, έτσι ώστε τελικώς να καθοριστεί το τοξικοπαθολογικό προφίλ του zebrafish. β) Στη δεύτερη μελέτη επιλέχθηκαν - με τυχαία δειγματοληψία - 120 γονιμοποιημένα ωάρια (2-4 κυττάρων) zebrafish και με τυχαία δειγματοληψία χωρίστηκαν σε 3 πειραματικές ομάδες (εις διπλούν) για κάθε μέταλλο και 1 ομάδα ελέγχου (εις διπλούν). Η κάθε πειραματική ομάδα καθώς και η ομάδα ελέγχου απαρτιζόταν από 15 γονιμοποιημένα ωάρια zebrafish και τοποθετούνταν σε ξεχωριστή θέση της πλάκας Corning®. Συγκεκριμένα, τα βαρέα μέταλλα εφαρμόστηκαν χωριστά σε μικρές ομάδες ωαρίων (n = 15), μετά από τυχαία επιλογή. Η εφαρμογή των βαρέων μετάλλων έγινε με 3 συγκεντρώσεις ξεκινώντας από 500 mg/l και τελειώνοντας με 5 * 10-2 mg/l (500 → 50 → 0,05 mg/l). Η κάθε πειραματική ομάδα καθώς και η ομάδα ελέγχου έγιναν επί δύο, δηλαδή σύνολο για την κάθε ομάδα 30 ωάρια. Υπήρχαν δηλαδή, 6 θέσεις της πλάκας Corning® για το κάθε μέταλλο με τις τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις (2 θέσεις για την κάθε συγκέντρωση) και 2 θέσεις της πλάκας Corning® με τις ομάδες ελέγχου, οι οποίες ήταν ίδιες και για τα 8 μέταλλα. Οι παρατηρήσεις που γινόντουσαν, αφορούσαν στην εκκόλαψη των γονιμοποιημένων ωαρίων, στην επιβίωση των προνυμφών, στις σκελετικές δυσμορφίες αυτών και σε άλλες λειτουργικές διαταραχές που μπορεί να προέκυπταν. Στις 3 πρώτες εκκολαπτόμενες προνύμφες από κάθε πειραματική ομάδα που δεν παρουσίαζαν ευθύς εξαρχής σκελετικά προβλήματα γινόταν η μέτρηση του καρδιακού ρυθμού. Οι παρατηρήσεις και οι ηχογραφήσεις γινόταν στις πρώτες 48 ώρες κάθε 6 ώρες και για τις επόμενες 48 κάθε 12 ώρες με τη βοήθεια ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και ενός στερεοσκοπίου με ενσωματωμένη κάμερα. Για τις ανάγκες μέτρησης του καρδιακού ρυθμού επιλέχθηκαν τυχαία τρεις προνύμφες για κάθε πειραματική ομάδα στις οποίες έγιναν επαναλαμβανόμενες μετρήσεις. Η μέτρηση του καρδιακού ρυθμού γινόταν 6 ώρες μετά την εκκόλαψη για κάθε πειραματική ομάδα. Στατιστικά εφαρμόστηκαν ανάλυση παλινδρόμησης Cox για να εξεταστούν οι διαφορές στο χρόνο εκκόλαψης και στους χρόνους επιβίωσης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων συγκέντρωσης του κάθε μετάλλου, η μη παραμετρική δοκιμασία log - rank για τη σύγκριση των κατανομών του χρόνου εκκόλαψης μεταξύ των 8 βαρέων μετάλλων όπως και μεταξύ των επιπέδων συγκέντρωσης του μετάλλου. Για τη συγκριτική μελέτη όλων των μετάλλων ως προς την επίδρασή τους στο zebrafish πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες log-rank χρησιμοποιώντας το SPSS v. 21, ενώ για την υπόθεση αναλογικών κινδύνων, ο υπολογισμός της ισχύος του Cox και το κοινό μοντέλο Frailty εφαρμόστηκαν με τη στατιστική γλώσσα R εξοπλισμένη με τα πακέτα συναρτήσεων «frailtypack» και «powerSurvEpi». Τέλος, εφαρμόστηκε το πακέτο «rpart» της γλώσσας R για την υλοποίηση του δέντρου ταξινόμησης. Αποτελέσματα: 1) Από τα ευρήματα της πρώτης μελέτης παρατηρήθηκε ότι ο χαλκός, το αλουμίνιο και το χρώμιο αποτελούν μια ομάδα υψηλότερης τοξικότητας στα βράγχια μεταξύ των 8 μετάλλων, ενώ ο σίδηρος και το χρώμιο, ως δύο βαρέα μέταλλα που έχουν στατιστικά υψηλότερη τοξική επίδραση στο ήπαρ και τους νεφρούς συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Επίσης διαπιστώθηκαν: α) παθολογικά συμπτώματα στα βράγχια των zebrafish (οίδημα στο χείλος των δευτερογενών νηματίων και υπερπλασία του επιθηλίου, καταστροφή στηρικτικών κυττάρων σε πρόδρομες τηλεαγγιεκτατικές διεργασίες στα δευτερογενή νημάτια, βοστρυχόμορφα δευτερογενή νημάτια και τηλεαγγειεκτασία στο σύνολο του μήκους των νηματίων, παρουσία ατρακτόμορφων ερυθρών αιμοσφαιρίων μεταξύ των δευτερογενών νηματίων, αποκόλληση του επιθηλίου των δευτερογενών νηματίων στην οιδηματική περιοχή με ύπαρξη άφθονου εοσινόφιλου υλικού εντός). β) παθολογικά συμπτώματα στους μύες των zebrafish (πρώιμη διήθηση μακροφάγων σε εκφυλισμένες μυϊκές ίνες που εμφανίζουν οξεία κατάτμηση και κενοτοπίωση, οξεία νεκρωτική μυΐτιδα συσχετιζόμενη με τοξίκωση, διογκωμένες υπερ-εωσινόφιλες μυϊκές ίνες (Hya) με απώλεια της τυπικής δοκιδώδους γράμμωσης, οξεία τμηματική νέκρωση μυϊκών ινών, ολοκληρωτική ρήξη μυϊκής ίνας). γ) παθολογικά συμπτώματα στο έντερο των zebrafish (ήπια ατροφία εντερικών λαχνών, ήπια έως μέτρια μείωση του ύψους των λαχνών, διαβρώσεις και έλκη στα περιφερικά άκρα των λαχνών, σοβαρή ελκωτική εντεροπάθεια, υποβλεννογόνια αιμορραγία του εντέρου, κυτταρική διήθηση εντέρου, εστιακή υπερπλασία εντέρου και τα υπερπλαστικά κύτταρα μικρότερα και περισσότερο βασίφιλα σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο). 2) Από τα ευρήματα της δεύτερης μελέτης παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο ποσοστό εκκόλαψης και επιβίωσης των προνυμφών μεταξύ της ομάδας ελέγχου και στις περισσότερες από τις πειραματικές ομάδες βαρέων μετάλλων σε διάφορες συγκεντρώσεις. Η υψηλότερη συγκέντρωση (500 mg/l) των συγκρινόμενων βαρέων μετάλλων είχε ως αποτέλεσμα τη συνολική θνησιμότητα ωαρίων/προνυμφών εντός 96 ωρών και σημαντικά χαμηλότερο προσδόκιμο ζωής. Η πιο σημαντική επίδραση στο χρόνο εκκόλαψης μεταξύ των δοκιμασμένων μετάλλων παρατηρήθηκε στον ψευδάργυρο και στο μολυβδαίνιο, σε αντίθεση με το σίδηρο που δεν διέφερε στατιστικά από την ομάδα ελέγχου. Ο χαλκός, το κοβάλτιο, το χρώμιο, το αλουμίνιο και το μαγγάνιο επηρέασαν τα ωάρια με στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάλογες των συγκεντρώσεων των μετάλλων. Επίσης, από τα ευρήματα της μελέτης παρατηρήθηκε σημαντική σχέση μεταξύ του καρδιακού ρυθμού των προνυμφών και της συγκέντρωσης των μετάλλων, και συγκεκριμένα, οι υψηλότερες συγκεντρώσεις των μετάλλων αντιστοιχούσαν σε υψηλότερο καρδιακό ρυθμό. Ακόμη, παρατηρήθηκε ότι ο ψευδάργυρος, το μολυβδαίνιο και ο χαλκός ως τα πιο τοξικά βαρέα μέταλλα προκαλώντας αυξημένο ποσοστό κινδύνου θνησιμότητας έως στις 96 ώρες και μικρότερο προσδόκιμο ζωής. Τέλος, οι σκελετικές παραμορφώσεις που παρατηρήθηκαν περιστασιακά δεν επηρέασαν σημαντικά το συνολικό προσδόκιμο ζωής των εκκολαφθέντων ωαρίων. Συμπεράσματα: Με βάση τα παρόντα ευρήματα διαπιστώνεται ότι η παρατεταμένη έκθεση του zebrafish σε συγκεντρώσεις βαρέων μετάλλων μπορεί να προκαλέσει παθολογικές αλλοιώσεις σε διάφορα όργανα. Επίσης, τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν την επίδραση των 8 βαρέων μετάλλων (Χαλκός, Ψευδάργυρος, Σίδηρος, Κοβάλτιο, Χρώμιο, Αλουμίνιο, Μαγγάνιο, Μολυβδαίνιο) στον ρυθμό επώασης των ωαρίων του zebrafish, στην επιβίωση των προνυμφών καθώς και στον καρδιακό ρυθμό. Έτσι, τονίζεται η σημασία της ποσοτικοποίησης και της απομάκρυνσης των βαρέων μετάλλων από τα διάφορα υδατικά συστήματα, με στόχο τον μετριασμό των επιπτώσεων στην υδρόβια ζωή και κατ’ επέκταση στην ανθρώπινη υγεία. Αυτές οι διαπιστώσεις παρουσιάζουν τις τοξικές επιδράσεις των βαρέων μετάλλων στην εμβρυϊκή ανάπτυξη του zebrafish και υποδηλώνουν την ανάγκη για περαιτέρω πειράματα για την αποσαφήνιση των διαφορετικών μηχανισμών στις οποίες βασίζονται τέτοιες αλλοιώσεις και οδηγούν στην ανάγκη της πρόληψης της εισόδου των βαρέων μετάλλων στο υδάτινο περιβάλλον.