Μελέτη της δράσης φωσφολιπασών D κατά την απόκριση του φυτού Gossypium hirsutum σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις

Abstract

Phospholipases D (PLD, E.C. 3.1.4.4) hydrolyze membrane phospholipids and are present in allorganisms studied. Plant PLDs exist in a wide range of isoforms, classified into six classes (α-ζ). Among them, α and δ are the most common. PLD activity in plants is involved in environmental stress responses via its product, phosphatidic acid (PtdOH), a signalling molecule. In the presence of aprimary alcohol, PLD hydrolytic activity is partially inhibited, as PLD transphosphatidylation reaction is preferentially catalyzed. In this study, we have found for the first time PLD activity in microsomal fraction of cultivated cotton (Gossypium hirsutum). Upon mechanical wounding -resembling tissue damage caused by biotic orabiotic factors- acute increase of PLDα isoform activity was observed in leaves, both locally and systemically. Endogenous PtdOH determination revealed analogous, rapid increase of its concentration locally, while duplication in PtdOH levels was observed as a late, local and systemic, response to wounding. Moreover, it was found that phosphatidylethanolamine is the prefered PLDα substrate and itis also preferentially consumed during early stages after wounding. However, after 30 min, a shift inselectivity towards phosphatidylcholine was observed, possibly due to other PLD isoforms’ activity, mainly δ. Expression analysis of PLDα and δ isoforms showed mRNA accumulation of both isoforms in the wounded tissue, but only PLDδ was induced in systemic leaves, suggesting that PLDδ is mainly responsible for systemic response to wounding. This was confirmed by PLDδ activity assay. Finally, expression experiments showed that lipoxygenase, NADPH oxidase and cellulose synthase arewound-induced, as well. In vivo effect of 1-butanol, that suppresses PLD-derived PtdOH production, inhibits the induction of all three genes tested, implying that they are possible downstream PLD targets during G. hirsutum stress.

Οι φωσφολιπάσες D (PLD, E.C. 3.1.4.4) είναι υδρολυτικά ένζυμα που δρουν σε φωσφολιπίδια των μεμβρανών και απαντώνται σε όλους τους οργανισμούς. Οι φυτικές PLD εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ποικιλία ισομορφών, που κατατάσσονται σε έξι τάξεις (α-ζ). Από αυτές, οι α και δ είναι οι πιο διαδεδομένες. Η δράση των PLD στα φυτά συνδέεται με αποκρίσεις σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις μέσω του παραγόμενου φωσφατιδικού οξέος (PtdOH), που δρα ως ενδοκυτταρικό σήμα. Στην περίπτωση παρουσίας πρωτοταγούς αλκοόλης, αναστέλλεται μερικώς η υδρολυτική δράση των PLDκαι καταλύεται η χαρακτηριστική για το ένζυμο αντίδραση μεταφωσφατιδυλίωσης. Στο καλλιεργούμενο βαμβάκι (Gossypium hirsutum) εντοπίστηκε για πρώτη φορά δραστικότητα PLDστο κλάσμα των μικροσωμάτων. Μετά από μηχανικό τραυματισμό -που προσομοιάζει με βλάβη στον ιστό προερχόμενη είτε από βιοτικούς είτε από αβιοτικούς παράγοντες- παρατηρήθηκε άμεση αύξηση της δραστικότητας της ισομορφής α της PLD στα φύλλα, τοπικά και συστημικά. Ο προσδιορισμός των ενδογενών επιπέδων PtdOH αποκάλυψε ανάλογη, ραγδαία αύξηση της συγκέντρωσης του λιπιδίου τοπικά, ενώ διπλασιασμός των επιπέδων του παρατηρήθηκε ως ύστερη, τόσο τοπική όσο και συστημική, απόκριση στον τραυματισμό. Επιπλέον, βρέθηκε πως η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη είναι το προτιμώμενο υπόστρωμα της PLDα και, επίσης, καταναλώνεται σε προτεραιότητα κατά τα πρώτα στάδια μετά τον τραυματισμό. Μετά από 30 min, όμως, βρέθηκε μετατόπιση της προτίμησης προς τη φωσφατιδυλοχολίνη, πιθανώς λόγω της δράσης άλλων ισομορφών και, κυρίως, της δ. Έλεγχος των επιπέδων RNA των ισομορφών PLDα και δ έδειξε πως τοπικά η έκφραση και των δύο ισομορφών επάγεται 30 min μετά τον τραυματισμό, ενώ συστημικά επάγεται η έκφραση μόνο της δ. Αυτό υποδεικνύει πως η PLDδ είναι κυρίως υπεύθυνη για τη συστημική απόκριση στον τραυματισμό, όπως επιβεβαιώνεται και από in vitro έλεγχο της δραστικότητάς της. Τέλος, πειράματα έκφρασης έδειξαν πως η λιποξυγενάση, η οξειδάση του NADPH και η συνθάση της κυτταρίνης επάγονται, επίσης, από τον τραυματισμό. Η in vivo επίδραση 1-βουτανόλης, που αναστέλλει την παραγωγή PtdOH, ανέστειλε και την επαγωγή των τριών γονιδίων, υποδεικνύοντας ότι αυτά είναι πιθανώς καθοδικοί στόχοι της δράσης της PLD κατά την καταπόνηση του φυτού.