Φωτοκαταλυτική αντικαρκινική δράση διοξειδίου του τιτανίου (TiO2): μηχανισμοί και εφαρμογές

Abstract

Titanium Dioxide (TiO2) is a material with a wide range of common as well as state-of -the-art applications. Actually it is demonstrably used in paints, plastics, cosmetics, artificial bone implants and also in optical coatings on dielectric mirrors. Furthermore, titanium dioxide is widely used in biomedical applications, due to its mechanical properties, biocompatibility and of course for photocatalysis purposes. It is now well established that photoexcited titanium dioxide (TiO2) can drive various chemical reactions due to its strong oxidizing and reducing ability and can also affect cellular activity, including applications in cancer cells treatment, and self-sterilized surfaces. It is crystallized in the form of rutile, anatase and broukite, while at low temperatures, it exists in amorphous condition. It is characterized as n-type semiconductor. Recently, many studies, in the field of cancer treatment research, suggest that the regulatory mechanisms of apoptotic-cell death play as important role in carcinogenesis as control mechanisms of cell proliferation do. Apoptosis is relevant to the majority of malignant tumorigenesis. The apoptotic activity occurs in a more vigorous rate in rapidly growing tumors. The usual applied treatments (chemotherapy, radiotherapy, hormonotherapy), conditionally aim to induce apoptosis. Recent studies demonstrated that TiO2 induces death by apoptosis in different types of cells, such as mesenchymal stem cells, osteoblasts and many others. Furthermore, the photocatalytic properties of TiO2-mediated toxicity have been shown to eradicate cancer cells, upon irradiation with light whose wavelength is <390 nm (UV-A), via the mechanism of oxidative stress. Photon energy generates pairs of electrons and holes which react with water and oxygen into the cells to yield reactive oxygen species (ROS), which have been proved to significantly damage cancer cells. Consequently, many scientific groups, including ours, have focused on the use of TiO2 as an anticancer agent in the presence of UV-A light. Given the high incidence of breast cancer (especially in Europe and United States of America) during the last decades, this neoplastic type was selected in order to examine the effects of TiO2 on breast cancer epithelial cells. The ultimate objective is to increase the spontaneous cell death of tumor cells, leaving unaffected the adjacent healthy cells and additionally to decrease the resistance of cancer cells to various treatments.The aim of this Ph. D. Thesis was to examine the possible toxicity of nanostructured TiO2 on breast cancer epithelial cells. Thus, cell toxicity of photo-activated TiO2 nanoparticles was assessed in two cancer cell lines, the MDA-MB-468 and the MCF-7, both derived from breast epithelium. Cells were irradiated, using UV-A light, in the presence of nanostructured titania. In recent years, it has been an increased concern about the nanotoxicology and the factors, which are intertwined with it. Due to the importance of this size class of particles, there is a need of clarification and establishment of the dependence between nanoparticle physicochemical properties and their cytotoxic potential. In this regard, specific parameters (percentage of crystal phase of anatase and rutile in the TiO2 formulation, particle size, concentration, chemical modification (doping) were studied in different types of TiO2 sol-gel and dispersions, after a complete characterization of nanoparticles (using micro Raman and Dynamic Light Scattering (DLS)). MTT colorimetric assay was employed to estimate the percentage of viable cells after each treatment. Propidium iodide (PI) flow cytometric (FACScan) assay permitted the examination of treatment effects on the cell cycle. Western blot analysis of proteins (caspase-mediated PARP cleavage, Bcl-2, Bcl-xL, Bax and Bad) expression and characterization as well as DNA laddering assay were used to detect cell apoptosis. We demonstrated that cell viability gradually decreases as the concentration of TiO2 sol-gel (2.6 - 20nm) increases, specifically in the highly malignant MDA-MB-468 cancer cells, whereas MCF-7 cells were not considerably affected. In particular, a concentration of about 16 μM TiO2 induces a reduction of about 50% in MDA-MB-468 cell population, while the same dose leaves 80% of the MCF-7 cells intact. A concentration of about 14-15 μM of UV-A-irradiated TiO2 reduced MDA-MB-468 cell viability by 40-50% while the relevant percentage of MCF-7 cell viability is 75%-85. Also, photo-excited TiO2 decreased the percentage of MDA-MB-468 cells (~70%), existing in G1 phase. PARP (113 kDa) is one of the main cleavage targets of activated caspases and participates in DNA repair, in a post stress plight. Cleavage of PARP no longer support the enzymatic DNA repair function, thus providing a marker of cells undergoing apoptosis. Photo-excited TiO2 sol-gel induced caspase-mediated PARP cleavage in MDA-MB-468 cells, compared with the control group. Also, Bcl-2 family proteins play a pivotal role in the regulation of cell apoptosis. Photo-excited TiO2 sol-gel was proven to decrease Bcl-2, and simultaneously increase Bax expression (confirmed apoptosis indices). Bcl-xL and Bad expression was not significantly affected by photo-excited TiO2 nanoparticles. These results are in agreement with the observed increase in PAPR cleavage. Finally, photo-excited TiO2 induced DNA laddering in MDA-MB-468 cells.Cell viability gradually decreases as the concentration of TiO2 Evonik P25 dispersion (anatase 75%/rutile 25%) (138.5 nm, zeta potential: ZP = (-11.7±8) mV) increases. In particular, a concentration of more than 24 μM TiO2 Evonik P25 induces a reduction of about 50% in MDA-MB-468 cell population, while the same dose leaves 70% of the MCF-7 cells intact. A concentration of about 19 μM of UV-A-irradiated TiO2 Evonik P25 reduced MDA-MB-468 cell population by 50%, leaving viable the 80% of MCF-7. Photo-excited TiO2 Evonik P25 induced PARP cleavage, increased Bax expression and DNA laddering in MDA-MB-468 cells.The viability of both cells lines gradually decreases as the concentration of TiO2 (Sigma Aldrich) dispersion (anatase 100%) (111.3 nm, ZP =(-16.7±9) mV) increases. In particular, a concentration of more than 20 μM TiO2 induces a reduction of about 50% in MDA-MB-468 cell population, while the same dose leaves 70% of the MCF-7 cells intact. A concentration of about 17 μM of UV-A-irradiated TiO2 reduced MDA-MB-468 cell population by 50%, leaving viable the 75% of MCF-7. TiO2 or photo-excited TiO2 (anatase 100%) induced PARP cleavage, increased Bax expression and DNA laddering in MDA-MB-468 cells.Concentrations of about 100 μΜ N-doped TiO2 (129.2 nm, ZP=(-11.4±7) mV) leave almost viable and functional more than 80% of both cell populations. Photo-excited, with visible light, N-doped TiO2 decreases gradually cell viability, and this effect is more intense on MDA-MB-468 cells, than MCF-7. In the presence of 40 μΜ photo-excited N-doped TiO2, 70% of MDA-MB-468 is viable and approximately 90% of MCF-7 cells. Photo-excited N-doped TiO2 induced a slight increase in PARP cleavage, increased Bax expression and DNA laddering in MDA-MB-468 cells.Our results also demonstrated that a concentration of 21 μΜ Ag-doped TiO2 (144.5 nm, ZP=(-14.8±8) mV) induced a decrease of 50% in MDA-MB-468 cells, leaving intact about 80% of MCF-7. In the presence of 18μΜ photo-excited Ag-doped TiO2, 50% of MDA-MB-468 cells and 70% of MCF-7 is still viable. Ag-doped or photo-excited Ag-doped TiO2 induced PARP cleavage, decreased Bcl-2 expression, increased Bax expression and DNA laddering in MDA-MB-468 cells.In conclusion, the most important results of this doctorate thesis are summarized as follows: •Sol-gel TiO2 was proven to be the most effective form of TiO2. This could be attributed to its homogeneity, compared to that of dispersions, which allows accurate estimation of the final TiO2 concentration in cell cultures. Also, size distribution showed that sol-gel nanoparticles size was smaller than the others, on average, since aggregates formation was established in the case of dispersions, which increase the final size of nanoparticles. •TiO2 Sigma Aldrich dispersion is more effective than the TiO2 Evonik P25, due to the different crystal phase. Sigma Aldrich is crystallized as anatase at 100%, while TiO2 Evonik P25 is an anatase/rutile mixture. The general trend appears to be that amorphous TiO2 particles produce more ROS than anatase TiO2 particles with the same size. In addition, 100% anatase TiO2 particles have higher ROS activities than anatase/rutile mixtures with the same sizes and pure rutile TiO2 particles. Thus, ROS activity of anatase/rutile TiO2 decreased as the fraction of rutile increased. •N-doped TiO2 showed a slight cytotoxic effect. However, our results are very encouraging and promising, as N-doping allows the replacement of UV-A with tissue - friendly visible light. •Doping TiO2 with silver is proven to be effective. •The molecular mechanism of TiO2 nanoparticles cytotoxicity was associated with increased pro-apoptotic Bax expression, decrease anti-apoptotic Bcl-2 expression and caspase-mediated poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage thus resulting in DNA fragmentation and programmed cell death-apoptosis. •Our data also demonstrated that the cytotoxicity of TiO2 nanoparticles is cell-dependent, since MCF-7 cells showed no significant response to TiO2 particles of both dispersions, compared to MDA-MB-468. These differences may be attributed to protein composition of the cell membrane and the manner that membrane proteins interact with the TiO2 particles. Weak TiO2 particle-membrane interactions in MCF-7 cells, could explain the high survival rates of particle-exposed cells. In contrast, TiO2 nanoparticles exerted significant toxicity on MDA-MB-468 cells, possibly as a result of increased and intense interactions between the TiO2 particles and the cell membrane. •Further studies, aiming at the development of visible-light-activated TiO2 nanoparticles, doped with nitrogen and other non-metals, for targeted cancer therapy, are in progress, thus avoiding UV-A irradiation, which is quite harmful for cells.

To διοξείδιο του Τιτανίου (TiO2) είναι ένα υλικό με ευρύ φάσμα κοινών εφαρμογών, αλλά και εφαρμογών υψηλής τεχνολογίας. Κρυσταλλώνεται σε μορφή ρουτιλίου, ανατάση και μπρουκίτη, ενώ σε χαμηλές θερμοκρασίες υπάρχει σε άμορφη κατάσταση. Χαρακτηρίζεται ως ημιαγωγός n τύπου. Χρησιμοποιείται σε χρώματα, πλαστικά, τρόφιμα, καλλυντικά, φάρμακα, τεχνητά εμφυτεύματα οστών (λόγω της βιοσυμβατότητάς του), σε οπτικές επιστρώσεις σε διηλεκτρικούς καθρέπτες, στον καθαρισμό τοξικών αποβλήτων, στην καταπολέμηση ανάπτυξης μικροοργανισμών, σε αποστειρώσεις χώρων. Τα τελευταία χρόνια, εργασίες που εστιάζουν στο πεδίο της έρευνας για τη θεραπεία του καρκίνου, υποστηρίζουν ότι οι μηχανισμοί ρύθμισης του κυτταρικού θανάτου και συγκριμένα η απόπτωση, παίζουν εξίσου σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση με τους μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Απόπτωση συναντάται στα περισσότερα κακοήθη νεοπλάσματα, ενώ εντονότερη αποπτωτική δραστηριότητα εμφανίζεται σε ταχέως αναπτυσσόμενους όγκους. Οι διάφορες μορφές θεραπείας του καρκίνου (χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, ορμονοθεραπεία), υπό συνθήκη, επάγουν την απόπτωση. Πρόσφατα, πολλές έρευνες, μεταξύ των οποίων και η παρούσα μελέτη, εστιάζουν στην πιθανή χρήση του, φωτο-ενεργοποιημένου με υπεριώδη ακτινοβολία, TiO2 σε ιατρικές εφαρμογές που στοχεύουν στη θεραπεία του καρκίνου. Δεδομένης της υψηλής συχνότητας του καρκίνου του μαστού, εισάγεται η ιδέα της δοκιμής της επίδρασης του TiO2 σε νεοπλασίες αυτής της μορφής. Στόχος είναι η αύξηση του αυθόρμητου κυτταρικού θανάτου στα κύτταρα του όγκου (το φωτο-ενεργοποιημένο (με UV-Α) ΤiΟ2, οδηγεί σε σχηματισμό ζευγών ηλεκτρονίων–οπών, που αντιδρούν με το νερό και το οξυγόνο, σχηματίζοντας ROS (reactive oxygen species) που τελικά οδηγούν σε οξειδωτικό στρες) αλλά και η μείωση της αντοχής των νεοπλασματικών κυττάρων στις διάφορες μορφές θεραπείας. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της πιθανής κυτταροτοξικής δράσης του φωτο-ενεργοποιημένου ΤiΟ2 στα καρκινικά κύτταρα. Έτσι, το ΤiΟ2 εισάγεται στα κύτταρα και εν συνεχεία πυροδοτεί ενδοκυτταρικές βιοχημικές αντιδράσεις, καθώς ενεργοποιείται με υπεριώδη ή και ορατή ακτινοβολία. Δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα μαστού, η μία χαμηλής (MCF-7) και η άλλη εντονότερης (MDA-MB-468) διαφοροποίησης, χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του TiO2, μέσω της μελέτης ειδικών παραμέτρων (ποσοστιαία σύσταση φάσεων ανατάση / ρουτιλίου, μέγεθος των νανοσωματιδίων, συγκέντρωση, χημική τροποποίηση), παρουσία ακτινοβολίας UV-A ή ορατού φωτός, στην επιβίωση των κυττάρων. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση λύματος-πηκτής (sol-gel) αλλά και εναιωρημάτων TiO2, ή χημικά τροποποιημένου TiO2, σε διαφορετικές φάσης κρυστάλλωσης, διαφορετικά μεγέθη και συγκεντρώσεις, μετά από πλήρη χαρακτηρισμό (micro Raman και DLS). Οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν ήταν το MTT assay, η κυτταρομετρία ροής (χρώση με P.I.), η τεχνική Western Blotting και η ανίχνευση του κατακερματισμένου DNA (DNA laddering). Παρατηρήθηκε επιλεκτική δράση του sol-gel TiO2 (2.6nm - 20nm) στα κύτταρα MDA-MB-468, ενώ τα MCF-7 δεν πλήττονται σοβαρά. Το φωτο-ενεργοποιημένο TiO2, οδήγησε σε μείωση (70%) του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G1. Η επιβίωση των κυττάρων μειώνεται βαθμιαία, αυξανομένης της συγκέντρωσης του TiO2. Σε συγκέντρωση 16 μM TiO2 επιβιώνει το 50% των κυττάρων MDA-MB- 468 και το 80% των MCF-7. Επιπλέον, συγκεντρώσεις μεταξύ των 14-15 μM φωτο-ενεργοποιημένου TiO2 οδηγούν σε ποσοστό επιβίωσης 40-50% για τα MDA-MB- 468, ενώ για τα MCF-7 το ποσοστό είναι 75–85%. Η επίδραση του φωτο-ενεργοποιημένου ή μη, TiO2 επάγει τη θραύση της PARP, που αποτελεί έναν αποπτωτικό δείκτη. Επιπλέον, οδηγεί σε μείωση της έκφρασης της Bcl-2, και ταυτόχρονη αύξηση της έκφρασης της Bax, επιβεβαιώνοντας το παραπάνω συμπέρασμα (τα επίπεδα των Bcl-xL και Bad παραμένουν αμετάβλητα). Τέλος, προκαλεί κατακερματισμό (laddering) του DNA στα κύτταρα MDA-MB-468. Η επιβίωση των κυττάρων μειώνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του εναιωρήματος TiO2 Evonik P25 (ανατάσης 75%/ρουτίλιο 25%) (138.5 nm και ζ δυναμικό: ZP=(-11.7±8) mV), για συγκεντρώσεις >20μM. Σε συγκέντρωση 24μM επιβιώνει το 50% των MDA-MB-468 και ποσοστό ~70% των MCF-7. Σε συγκέντρωση 19 μM φωτο-ενεργοποιημένου (με UV-Α) TiO2 Evonik P25 επιβιώνει το 50% των MDA-MB-468 και ποσοστό ~80% των MCF-7 κυττάρων. Το φωτο-ενεργοποιημένο εναιώρημα TiO2 στα MDA-MB-468, επάγει τη θραύση της PARP, οδηγεί σε μικρή αύξηση της Bax και προκαλεί ασθενές DNA laddering. Η επιβίωση των κυττάρων μειώνεται καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του εναιωρήματος TiO2 (Sigma Aldrich) (ανατάσης 100%) (111.3 nm και ζ δυναμικό: ZP=(-16.7±9) mV). Για συγκέντρωση >20 μM επιβιώνει το 50% των κυττάρων MDA-MB-468 και το 70% των MCF-7. Σε συγκέντρωση 17 μM φωτο-ενεργοποιημένου (με UV–Α) TiO2 Sigma Aldrich επιβιώνει το 50% των MDA-MB-468 και το 75% των MCF-7 κυττάρων. Η επίδραση του φωτο-ενεργοποιημένου ή μη, TiO2 (Sigma Aldrich), στα MDA-MB-468, επάγει τη θραύση της PARP, οδηγεί σε μικρή αύξηση της Bax και προκαλεί DNA laddering. Για συγκεντρώσεις ακόμη και 100μΜ εναιωρήματος τροποποιημένου με άζωτο TiO2 (N-doped TiO2) (129.2 nm) και ζ δυναμικό: ZP=(-11.4±7) mV) επιβιώνει περισσότερο από το 80% των κυττάρων MDA-MB-468 και των MCF-7. Το φωτο-ενεργοποιημένο με ορατή ακτινοβολία, N-doped TiO2, μειώνει βαθμιαία τον πληθυσμό των κυττάρων και των δύο κυτταρικών σειρών, με ελαφρά εντονότερη δράση στα MDA-MB-468. Σε συγκέντρωση 40μΜ επιβιώνει το 70% του πληθυσμού των MDA-MB-468 και το 90% των MCF-7 κυττάρων. Επάγεται η θραύση της PARP, σε πολύ μικρό ποσοστό, οδηγεί σε πολύ μικρή αύξηση της Bax και προκαλεί ασθενές DNA laddering. Η συγκέντρωση 21μΜ εναιωρήματος τροποποιημένου με Άργυρο TiO2 (Ag-doped TiO2) (144.5 nm) και ζ δυναμικό: ZP=(-14.8±8) mV), επάγει το θάνατο στο 50% των κυττάρων MDA-MB-468, αφήνοντας το 80% των κυττάρων MCF-7 σχεδόν ανεπηρέαστο. Σε συγκέντρωση 18 μΜ φωτο-ενεργοποιημένου (με UV–Α) Ag-doped TiO2 επιβιώνει τελικά περίπου το 50% των κυττάρων MDA-MB-468 και το 70% των MCF-7. Το φωτο-ενεργοποιημένο με UV-A ή μη, Ag-doped TiO2 επάγει τη θραύση της PARP, οδηγεί σε μείωση της Bcl-2, σε αύξηση της Bax και προκαλεί DNA laddering. Συμπερασματικά, τα σημαντικότερα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται ως εξής:•Το sol-gel TiO2, είναι πιο δραστικό από όλα τα εναιωρήματα που δοκιμάστηκαν. Είναι περισσότερο ομοιογενές από τα εναιωρήματα, επιτρέποντας ακριβέστερη εκτίμηση της τελικής συγκέντρωσης TiO2 στα δείγματα. Επιπλέον, η κατανομή του μεγέθους των νανοσωματιδίων σε μορφή sol-gel, δείχνει ότι κατά μέσο όρο είναι πολύ μικρότερα στο τελικό διάλυμα, συγκρινόμενα με τα εναιωρήματα, αφού σε μορφή εναιωρήματος ευνοείται ο σχηματισμός συσσωματωμάτων, που αυξάνει το μέγεθος των σωματιδίων. •Το εναιώρημα TiO2 Sigma Aldrich είναι δραστικότερο από το Degussa P25, λόγω της διαφορετικής φάσης κρυστάλλωσης. Το Sigma Aldrich, είναι 100% ανατάσης, ενώ στο Degussa P25, συνυπάρχουν ανατάσης (75%) και ρουτίλιο (25%). Η ύπαρξη φάσης ρουτιλίου μειώνει τη δραστικότητα. Ο καθαρός ανατάσης αυξάνει την ποσότητα των ROS. Η δραστικότητα του TiO2 μειώνεται μεταβαίνοντας από το άμορφο TiO2, στον καθαρό ανατάση, στον ανατάση/ρουτίλιο και τέλος στο καθαρό ρουτίλιο.•Το N-doped TiO2 παρ’ όλο που δεν έδειξε θεαματική κυτταροτοξική δράση, εν τούτοις προσφέρει αποτελέσματα ιδιαίτερα ενθαρρυντικά, αφού επιτρέπει την ενεργοποίηση με ορατή ακτινοβολία. Το Ag-doped TiO2 είναι αρκετά δραστικό.•Η κυτταροτοξικότητα του φωτο-ενεργοποιημένου TiO2 σχετίζεται με το μηχανισμό της απόπτωσης. Το φωτο-ενεργοποιημένο TiO2 επάγει τη θραύση της PARP στα κύτταρα MDA-MB-468, αλλά όχι και στα MCF-7, ενώ η μείωση της Bcl-2 και η αύξηση της Bax, επιβεβαιώνουν κατά περίπτωση, το συμπέρασμα αυτό, σε συνδυασμό με την εικόνα του κατακερματισμένου DNA. • Η επιλεκτική τοξικότητα των νανοσωματιδίων TiO2 μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, πιθανώς σχετίζεται με τις ιδιότητες της επιφάνειας των κυττάρων. Η διαφορετική σύσταση της κυτταρικής μεμβράνης ίσως διαφοροποιεί και τις αλληλεπιδράσεις μεμβρανικών πρωτεϊνών με το TiO2, που για τα MCF-7 είναι μάλλον ασθενέστερες, με αποτέλεσμα τον επιλεκτικό θάνατο των MDA-MB-468. •Η βελτιστοποίηση της μεθόδου θα μπορούσε να περιλαμβάνει την προσπάθεια αντικατάστασης ης ακτινοβολίας UV-A, με ορατό φως. Αυτό επιτυγχάνεται με τροποποίηση του TiO2 με άζωτο, αλλά με μέθοδο που να συμβάλλει στη δραστικότητά του.