Εφαρμογή νέων τεχνικών για την ανίχνευση μοριακών διαταραχών σε ασθενείς με δυστροφινοπάθειες χωρίς έλλειψη στο γονίδιο της δυστροφίνης

Abstract

IntroductionMutation detection in the DMD gene has historically been challenging, duemainly to the large size of the gene and the fact that over 90% of the pointmutations are unique. Although hot spots have been reported for exondeletions and duplications no such spot has been identified for pointmutations which are scattered across the whole gene.Materials and MethodsIn our study we present a general overview of the molecular analysis findingsin 645 patients (608 male and 37 female) referred to our department duringthe past 2 decades for DMD gene testing. Exon deletions and duplicationswere identified using either the standard 18 exon multiplex PCR (mPCR) orthe MLPA method while Enzymatic Cleavage Mismatch Analysis protocol(Vogiatzakis et al, 2007; 2010) followed by direct DNA sequencing wasperformed for the detection of point mutations.The deletion boundaries, where not apparent, were further investigated witheither mPCR or MLPA.ResultsThe study revealed 308 alterations comprising 254 exon deletions, 22 exonduplications and 32 point mutations. Several polymorphisms were alsoidentified on the DMD gene, of which 6 single nucleotide alterations remainstill under investigation regarding their possible pathogenic character.Although the majority of the mutations were detected along the DMD genehotspot regions (as mentioned in literature), minor discrepancies were notedconcerning the boundaries of the exons’ deletions.Conclusions1. A non-random distribution concerning a high incidence of deletions in thedistal hot spot (exons 45-55) and duplications in exons 2-8 was noticed and isconsistent with the results reported for previous large cohorts (Tuffery-Giraud S et al, 2009, Aartsma-Rus A et al, 2006). Among the 32 pointmutations disclosed, a rather high detection rate was noted in exons 21 and66 having 3 different mutations each. 2. This study revealed 31 point mutations on the DMD gene. Specifically, 37%frameshift mutation 17% splice site mutation and 46% stop codon mutation.All the results are in accordace to the international literature.3.Mutations in the DMD gene should be studied even in individuals withchronic subclinical CK elevations such as DMD carriers4.It should be noted that 251 of the patients (males and females) werereferred solely due to minor BMD-like phenotypic symptoms such ashyperCKemia thus explaining the reduced (47%) detection rate amongreferrals.

Εισαγωγή Η ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα απαιτητική κυρίως λόγω του μεγάλου μεγέθους του γονιδίου (79 εξόνια, 2,4Kb). Παρόλο που έχουν αναφερθεί στην βιβλιογραφία «θερμές περιοχές» (Hot Spot) όπου συσσωρεύονται ελλείψεις και διπλασιασμοί εξονίων, δεν έχει αναφερθεί ένα ανάλογο σημείο συσσώρευσης σημειακών μεταλλάξεων οι οποίες απαντώνται διάσπαρτες καθ όλο το μήκος του γονιδίου. Μεθοδολογία. Στην μελέτη αυτή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του ελέγχου 647 ασθενών (608 άρρενα άτομα και 37 θήλεα) που παραπέμφθηκαν στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών τις δυο τελευταίες δεκαετίες για έλεγχο για δυστροφινοπάθειες. Οι ελλείψεις και οι διπλασιασμοί εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας το κλασικό πολλαπλό PCR 18 εξονίων αλλά και την τεχνική πολλαπλής ενίσχυσης υβριδοποιημένων ανιχνευτών με το ένζυμο της λιγάσης (Multiplex Ligation –dependant Probe Amplification, MLPA). Οι σημειακές μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σάρωσης ECMA (EnzymaticCleavage Mismatch Analysis protocol (Vogiatzakis et al, 2007; 2010) η οποία τιτλοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής αρχικά για τις ανάγκες της παρούσας μελέτης. Οι σημειακές μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του DNA (Direct DNA sequencing). Τα όριατων μεταλλάξεων (όπου δεν ήταν προφανή) μελετήθηκαν περαιτέρω με πολλαπλό PCR ή MLPA. Για την σύγκριση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε η τράπεζα μεταλλάξεων για το γονίδιο DMD του πανεπιστημίου του Leiden,Ολλανδία (www.dmd.nl).Αποτελέσματα. Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε συνολικά 308 μεταλλάξεις και ειδικότερα 254 ήταν ελλείψεις εξονίων, 24 διπλασιασμοί και 32 σημειακές μεταλλάξεις. Επίσης ταυτοποιήθηκαν αρκετοί πολυμορφισμοί του γονιδίου της δυστροφίνης από τους οποίους 6 χρήζουν περαιτέρω μελέτης λόγω της αμφίβολης παθογένειας τους. Παρόλο που η πλειοψηφία των μεταλλάξεων που βρέθηκαν εντοπίζονται στα γνωστά «θερμά σημεία» του γονιδίου παρατηρήθηκαν διαφορές στα όρια των μεταλλάξεων σε σχέση με τα αναφερόμενα στην διεθνή βιβλιογραφία. Συμπεράσματα. 1. Παρατηρήθηκε μη τυχαία κατανομή μεγάλου αριθμού ελλείψεων στο κεντρομερικό «θερμό σημείο» (εξόνια 45-55) καθώς επίσης και μεγάλου αριθμού διπλασιασμών στο αμινοτελικό «θερμό σημείο» (εξόνια 2-8). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με την διεθνή βιβλιογραφία, (Tuffery-GiraudS et al, 2009, Aartsma-Rus A et al, 2006). Ανάμεσα στις 32 σημειακές μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν, παρατηρήθηκε συσσώρευση μεταλλάξεων στα εξόνια 21 και 66, όπου με τρείς διαφορετικές μεταλλάξεις στο κάθε ένα.2. Κατά την διάρκεια της μελέτης αποκαλύφθηκαν 31 σημειακές μεταλλάξεις του γονιδίου της δυστροφίνης σε ασθενείς με μυϊκή δυστροφία Duchenne Becker. Συγκεκριμένα, 37% των μεταλλάξεων ήταν μεταλλάξεις αλλαγής πλαισίου ανάγνωσης, 17% ήταν μεταλλάξεις σε σημεία ματίσματος και 46% μεταλλάξεις που προκαλούν πρόωρο κωδικόνιο λήξεις. Τα αποτελέσματα της μελέτης συμφωνούν και με την διεθνή βιβλιογραφία παρόλο που ο αριθμός των ασθενών δεν ήταν ικανός για να διευκρινιστεί το ποσοστό των σημειακών μεταλλάξεων σε ασθενείς με Duchenne, και Beckerξεχωριστά.3. Απαιτείται η μελέτη των μεταλλάξεων στο γονίδιο της δυστροφίνης ακόμα και στις περιπτώσεις ασθενών που εμφανίζουν απλά υποκλινικά συμπτώματα(όπως αυξημένα CPK) καθώς και σε περιπτώσεις φορέων της νόσου.4. Η δυσκολία μοριακής επιβεβαίωσης πολλών νευρομυικών παθήσεων οδηγεί στην παραπομπή για έλεγχο του γονιδίου DMD περιστατικών όπου ηδυστροφινοπάθεια αποτελεί διαφορική διάγνωση. Ως εκ τούτου πολλοί ασθενείς παραπέμπονται χωρίς να έχουν την τυπική κλινική εικόνα δυστροφινοπάθειας (αρκετές παραπομπές έχουν γίνει με μοναδικό εύρημα αυξημένα CPK στο αίμα) γεγονός που ερμηνεύει το μειωμένο ποσοστό διάγνωσης στην παρούσα μελέτη.