Μελέτη της σηματοδοτικής οδού mTOR στα κακοήθη νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων

Abstract

INTRODUCTION: Salivary gland tumors (SGTs) affect major or minor salivary glands (SGs), and represent 3.0-6.5% of all head and neck tumors. SGTs are a heterogeneous group of neoplasms with unknown etiology and pathogenesis, broad histopathologic spectrum and variable biological behavior. mTOR signaling pathway controls cell growth, survival, proliferation and other important cell functions. mTOR is activated by upstream molecules, such as Akt, and in turn activates important target molecules, such as S6K1 and 4EBP1. mTOR-induced S6K1 phosphorylation leads to phosphorylation of S6 (40S ribosomal protein component), whereas 4EBP1 phosphorylation causes dissociation of 4EBP1 from eIF4E, thus allowing for initiation of the protein translation machinery. The mTOR signaling pathway plays an important role in tumorogenesis of several neoplasms, making mTOR an attractive target for cancer therapy. Dysregulation of the mTOR signaling pathway has been documented in a variety of human cancers, such as breast, prostate, lung, urinary bladder, ovarian, pancreatic and head and neck. Despite the confirmed role of mTOR signaling pathway in carcinogenesis, there is limited information about the involvement of this pathway in SG neoplasms.The aim of this study was to investigate the activation of mTOR signaling pathway in SG neoplasms. In particular, the immunohistochemical expression of important upstream and downstream mTOR molecules was studied in benign (pleomorphic adenomas) and malignant SGTs (of several histopathologic subtypes), compared to control group (normal minor SGs). MATERIALS AND METHODS: This study's material consisted of 39 malignant minor SGTs of various histologic subtypes, which were compared with 13 benign minor SGTs (pleomorphic adenomas) and 8 control cases of normal minor SGs. All cases were collected from the archives of the Department of Oral Medicine and Pathology, Dental School, University of Athens. Patient available information from biopsy submission forms and histopathological reports were reviewed and information on demographics (age, sex) and clinical features were recorded. H&E sections of each tumor were reviewed to confirm the histopathological diagnosis, according to the criteria of WHO 2005 for SGT classification.Immunohistochemical protein expression of specific molecules of mTOR pathway was assessed in sections of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues using an automated immunohistochemistry system by applying the following antibodies: phospho-AKT (Ser473), 4E-BP1, phospho-4E-BP1 (Thr37/46), S6 Ribosomal Protein, phospho-S6 RibosomalProtein (Ser235/236) and eIF4E.Immunohistochemical reactivity for all stains was graded in a semi-quantitative manner according to the percentage of positive cells: (0) 0%, (1) <20%, (2) 20-50% and (3) >50%, and the intensity of staining: (0) no staining, (1) weak, (2) moderate, or (3) strong. Moreover, a combined score of immunohistochemical positivity (0, 2-6) was calculated by adding the individual scores for percentage of positive cells and intensity of staining.Statistical analysis was performed: immunohistochemical scores (intensity, positivity and total scores) for all molecules were evaluated and compared among malignant and benign neoplasms and normal SG tissues using the non-parametric Kruskal Wallis and Mann Whitney tests. Moreover, nonparametric Spearman’s test was used for correlation of the expression of various molecules. All statistical differences were considered significant at p≤0.05. RESULTS: Immunohistochemical Expression of 4EBP1 and p4EBP14EBP1 exhibited mainly cytoplasmic and occasionally nuclear immunoreactivity and was observed in 100% of malignant and benign SGTs and in 87.5% of control cases. The mean positivity ,intensity and total scores for 4EBP1 were 2.67, 2.31, 4.97 in malignant cases, 1.77, 1.54, 3.31 in benign cases and 1.38,0.88 and 2.25 in control cases, respectively.Statistical analysis revealed significant differences between malignant and benign neoplasms (p<0.05), malignant and control cases (p<0.05), and benign and control cases (p<0.05).Immunohistochemical expression of p4EBP1 was both cytoplasmic and nuclear and was found in 97.4% of malignant cases and in 100% of benign cases, while it was negative in all control cases. The mean positivity, intensity, and total scores for p4EBP1 were 2.59, 2.05, 4.64 in malignant neoplasms, and 1.69, 1.38, and 3.07 in benign tumors, respectively. Statistical analysis revealed significant higher levels in malignant SGTs compared to benign SGTs (p<0.05) and normal SGs (p<0.05), as well as in benign SGTs compared to normal SGs (p<0.05).Immunohistochemical Expression of S6 and pS6S6 immunohistochemical expression was cytoplasmic, observed in 100% of malignant SGTs, 92.3% of benign SGTs and 37.5% of normal SGs.The mean positivity, intensity, and total scores for S6 were 2.46, 2.15 and 4.61 in malignant cases, 1.54, 1.77, and 3.31 in benign tumors and 0.63, 0.50, and 1.13 in normal SGs, respectively.Statistical analysis revealed significant differences between malignant and benign cases regarding positivity (p<0.05) and total score (p<0.05). Significant differences were also observed between malignant SGTs and normal SGs regarding intensity, positivity and total score (p<0.05), as well as between benign SGTs and normal SG (p<0.05).pS6 immunohistochemical expression was cytoplasmic, detected in 95% of malignant tumors and 76.9% of benign cases. All studied normal SG were negative. The mean scores for positivity, staining intensity and total score were 2.31, 2.28 and 4.59 in malignant cases and 0.92, 0.85 and 1.77 in benign tumors, respectively. Statistical significant differences were noticed between malignant and benign tumors (p<0.05), between malignant cases and normal SGs (p<0.05), as well as between benign tumors and normal SG (p<0.05).Immunohistochemical Expression of pAKTImmunohistochemical expression of pAKT was predominantly cytoplasmic and was detected in 100% of all benign and malignant tumors and in 75% of normal SGs.The mean positivity, intensity, and total scores for pAKT were 2.69, 2.38 and 5.07 in malignant cases, 2.23, 2.00, and 4.23 in benign SGTs, and 1.10, 1.00 and 2.10 in normal SGs, respectively.Statistical significant differences were found regarding positivity (p<0.05) and total scores (p<0.05) between malignant and benign SGTs, as well as between malignant and normal SG (p<0.05) and between benign and normal SG (p<0.05) in all studied cases.Immunohistochemical Expression of eIF4EeIF4E was expressed in the cytoplasm. Positive immunostaing was expressed in 76.9% of malignant tumors, 69.2% of benign cases and in a single control case (12.5%). The mean positivity, intensity, and total scores were 1.18, 1.23, and 2.41 in malignant cases, 1.08, 1.15 and 2.23 in benign tumors, and 0.13, 0.13 and 0.25 in normal SGs, respectively.Statistical analysis revealed no significant differences between malignant and benign tumors. In contrast, there were significant differences between benign tumors and normal SG (p<0.05), as well as between malignant cases and normal SG (p<0.05). DISCUSSION – CONCLUSIONS: Despite the evidence in favor of mTOR signaling pathway involvement in various oncogenic processes, only a few published studies have investigated mTOR signaling activation in SGTs. In this study, the immunohistochemical expression of crucial components of the mTOR pathway was investigated in benign and malignant SGTs compared to normal SGs. Specifically, the levels of the upstream activator (pAKT) and the downstream substrates (4EBP1, S6 and eIF4E) were assessed and found to be expressed and activated in SGTs.Higher expression levels were observed for all studied molecules in neoplastic tissues (benign and malignant) compared to normal SGs, as well as in malignant compared to benign tumors. This progressive increased expression and activation of mTOR-related molecules from normal minor salivary glands to malignant tumors strongly suggests their involvement in oncogenic processes of glandular epithelium. Further investigation is needed to determine mTOR-related prognostic markers and therapeutic targets that may take part in SG tumorigenesis

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Τα νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων προσβάλλουν τους μείζονες ή τους ελάσσονες αδένες και αποτελούν το 3.0-6.5% του συνόλου των νεοπλασμάτων της κεφαλής και του τραχήλου. Αποτελούν μια ετερογενή ομάδα νεοπλασμάτων με άγνωστη αιτιοπαθογένεια, ευρύ φάσμα ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών και ποικίλη βιολογική συμπεριφορά.Η οδός σηματοδότησης mTOR ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και άλλες σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου. Η mTOR ενεργοποιείται από ανιόντα μόρια, όπως το Akt, και με τη σειρά της ενεργοποιεί σημαντικά μόρια στόχους, όπως η S6K1 και η 4EBP1. Η φωσφορυλίωση της S6K1 οδηγεί στην φωσφορυλίωση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 (συστατικού της ριβοσωμικής υπομονάδας 40S), ενώ η φωσφορυλίωση της 4EBP1 επάγει την απελευθέρωσή του παράγοντα eIF4E, επιτρέποντας την εκκίνηση της μετάφρασης.Η σηματοδοτική οδός mTOR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ποικίλων νεοπλασμάτων, καθιστώντας το μόριο mTOR ελκυστικό αντικαρκινικό θεραπευτικό στόχο. Έχουν εντοπισθεί αρκετές δυσλειτουργίες των μορίων της σηματοδοτικής οδού mTOR σε διάφορα είδη καρκίνου, όπως μαστού, προστάτη, πνεύμονα, ουροδόχου κύστεως, ωοθηκών, παγκρέατος και κεφαλής- τραχήλου. Παρά τον αποδεδειγμένο ογκογενετικό της ρόλο, η ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού mTOR σε νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η διερεύνηση της ενεργοποίησης της σηματοδοτικής οδού mTOR στα νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ανοσοϊστοχημική έκφραση σημαντικών κομβικών ανιόντων και κατιόντων μορίων της οδού mTOR σε καλοήθεις όγκους (πλειόμορφα αδενώματα) και σε διάφορους τύπους κακοηθειών των ελασσόνων σιαλογόνων αδένων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (φυσιολογικοί ελάσσονες σιαλογόνοι αδένες). ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 39 περιπτώσεις κακοήθων νεοπλασμάτων των ελασσόνων σιαλογόνων αδένων ποικίλων ιστοπαθολογικών υποτύπων, οι οποίες συγκρίθηκαν με 13 περιπτώσεις καλοήθων όγκων (πλειομόρφων αδενωμάτων) των ελασσόνων σιαλογόνων αδένων και 8 περιπτώσεις φυσιολογικών ελασσόνων σιαλογόνων αδένων. Όλες οι παραπάνω περιπτώσεις συλλέχθηκαν από το Αρχείο του Ιστοπαθολογικού Εργαστήριο της Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών.Καταγράφηκαν οι διαθέσιμες πληροφορίες από τα τα παραπεμπτικά και τις ιστοπαθολογικές εκθέσεις, συμπεριλαμβάνοντας τα δημογραφικά (ηλικία, φύλο) και κλινικά στοιχεία όλων των περιπτώσεων και έγινε επιβεβαίωση της ιστοπαθολογικής διάγνωσης με επανεξέταση - επαναξιολόγηση των πλακιδίων αιματοξυλίνης- ηωσίνης, χρησιμοποιώντας τα κριτήρια του WHO 2005 για την ταξινόμηση των όγκων των σιαλογόνων αδένων.Πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης συγκεκριμένων μορίων της οδού mTOR σε τομές από τους κύβους παραφίνης όλων των περιπτώσεων, χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο σύστημα ανοσοϊστοχημείας και τα παρακάτω αντισώματα: phospho-AKT (Ser473), 4E-BP1, phospho-4E-BP1 (Thr37/46), S6 RibosomalProtein, phospho-S6 RibosomalProtein (Ser235/236) και eIF4E. Η ανοσοϊστοχημική έκφραση όλων των αντισωμάτων αξιολογήθηκε με ημιποσοτικό τρόπο, σύμφωνα με το ποσοστό των θετικών κυττάρων: (0) 0%, (1) <20%, (2) 20-50% and (3) >50%, και την ένταση της χρώσης: (0), καθόλου χρώση, (1) ασθενής χρώση, (2) μέτρια χρώση, (3) έντονη χρώση. Επιπλέον υπολογίσθηκε το συνολικό άθροισμα (0, 2-6), ως το άθροισμα των βαθμών του ποσοστού και της έντασης.Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση με αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημικών αποτελεσμάτων (ποσοστό, ένταση, συνολικό άθροισμα) για όλα τα μόρια στο σύνολο των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων και της ομάδας ελέγχου με τις μη παραμετρικές δοκιμασίες Kruskal-Wallis και Mann-Whitney’s. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε η μη παραμετρική στατιστική δοκιμασία Spearman’stest για τη συσχέτιση της έκφρασης των μορίων. Όλα τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά στο επίπεδο p≤0,05.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ανοσοϊστοχημική έκφραση της 4EBP1 και της p4EBP1Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της 4EBP1 ήταν κυρίως κυτταροπλασματική και σπανίως πυρηνική και παρατηρήθηκε στο 100% των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων και στο 87,5% της ομάδας ελέγχου.Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,67, 2,31 και 4,97 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 1,77, 1,54 και 3,31 στα καλοήθη νεοπλάσματα και 1,38, 0,88 και 2,25 στην ομάδα ελέγχου. Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων (p<0,05), κακοήθων νεοπλασμάτων και ομάδας ελέγχου (p<0,05) και καλοήθων νεοπλασμάτων και ομάδας ελέγχου (p<0,05).Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της p4EBP1 ήταν κυτταρο-πλασματική και πυρηνική και παρατηρήθηκε στο 97,4% των κακοήθων νεοπλασμάτων και στο 100% των καλοήθων νεοπλασμάτων, ενώ ήταν αρνητική σε όλες τις περιπτώσεις της ομάδας ελέγχου. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,59, 2,05 και 4,64 στα κακοήθη νεοπλάσματα και 1,69, 1,38 και 3,08 στα καλοήθη νεοπλάσματα. Ο στατιστικός έλεγχος έδειξε υψηλότερες τιμές στα κακοήθη νεοπλάσματα συγκρινόμενα με τα καλοήθη (p<0,05) και τους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες(p<0,05), όπως επίσης και στα καλοήθη σε σχέση με τους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες (p<0,05).Ανοσοϊστοχημική έκφρασητης S6 και της pS6Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της S6 ήταν κυτταροπλασματική και παρατηρήθηκε σε ποσοστό 100% στα κακοήθη νεοπλάσματα, 92,3% στα καλοήθη και 37,5% στους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες.Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,46, 2,15 και 4,62 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 1,54, 1,77 και 3,31 στα καλοήθη και 0,63, 0,50 και 1,13 στους φυσιολογικούς αδένες.Παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων (p<0,05) και το συνολικό άθροισμα (p<0,05) μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων. Επίσης, στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν για όλες τις παραμέτρους (ποσοστό, ένταση και συνολικό άθροισμα) μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05) , όπως επίσης και μεταξύ καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05). Η ανοσοϊστοχημική έκφραση της pS6 ήταν κυτταροπλασματική και ανιχνεύθηκε στο 95% των κακοήθων και 76,9% των καλοήθων νεοπλασμάτων. Στους φυσιολογικούς ελάσσονες αδένες, η έκφραση της pS6 υπήρξε αρνητική σε όλες τις μελετώμενες περιπτώσεις. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,31, 2,8 και 4,59 στα κακοήθη και 0,92, 0,85 και 1,77 στα καλοήθη νεοπλάσματα. Στατιστικά σημαντικά διαφορές διαπιστώθηκαν μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων (p<0,05), όπως επίσης και μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05) και μεταξύ καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05).Ανοσοϊστοχημική έκφραση της pAKTΗ ανοσοϊστοχημική έκφραση της pΑΚΤ ήταν κυρίως κυτταροπλασματική και διαπιστώθηκε σε ποσοστό 100% των κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων και σε ποσοστό 75% των φυσιολογικών ελασσόνων σιαλογόνων αδένων. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 2,69, 2,38 και 5,08 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 2,23, 2,00 και 4,23 στα καλοήθη νεοπλάσματα και 1,10, 1,00 και 2,10 στους φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες.Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων όσο αφορά στο ποσοστό θετικών κυττάρων (p<0,05) και στο συνολικό άθροισμα (p<0,05), όπως και μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών αδένων(p<0,05) ή καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών αδένων (p<0,05) για όλες τις μελετώμενες περιπτώσεις.Ανοσοϊστοχημική έκφραση της eIF4EΗ ανοσοϊστοχημική έκφραση της eIF4E ήταν κυτταροπλασματική. Διαπιστώθηκε θετική στο 76,9% των κακοήθων νεοπλασμάτων, στο 69,2% των καλοήθων νεοπλασμάτων και σε μία μόνο περίπτωση (12,5%) της ομάδας ελέγχου. Οι μέσες τιμές για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, την ένταση της χρώσης και το συνολικό άθροισμα ήταν 1,18, 1,23 και 2,41 στα κακοήθη νεοπλάσματα, 1,08, 1,15 και 2,23 στα καλοήθη νεοπλάσματα και 0,13, 0,13 και 0,25 στους φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ κακοήθων και καλοήθων νεοπλασμάτων. Αντίθετα, στατιστικά σημαντικές διαφορές καταγράφηκαν μεταξύ καλοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05), όπως επίσης και μεταξύ κακοήθων νεοπλασμάτων και φυσιολογικών σιαλογόνων αδένων (p<0,05). ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Παρά τον αποδεδειγμένο ογκογενετικό ρόλο της mTOR σηματοδότησης, λίγες δημοσιευμένες ερευνητικές εργασίες αναφέρονται στην ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού mTOR σε νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση κομβικής σημασίας συστατικών της οδού mTOR σε κακοήθη και καλοήθη νεοπλάσματα ελασσόνων σιαλογόνων αδένων σε σύγκριση με φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκαν τα επίπεδα τόσο ανιόντων ρυθμιστών (pAKT), όσο και κατιόντων μορίων-στόχων (4EBP1, S6 και eIF4E) και διαπιστώθηκε η έκφραση και ενεργοποίησή τους σε όγκους των σιαλογόνων αδένων. Παρατηρήθηκε ότι τα μελετώμενα μόρια εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα στα νεοπλάσματα (καλοήθη και κακοήθη) των σιαλογόνων αδένων σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς σιαλογόνους αδένες, όπως επίσης και στα κακοήθη νεοπλάσματα σε σύγκριση με τα καλοήθη. Η προοδευτική αυτή αύξηση της έκφρασης και ενεργοποίησης της mTOR σηματοδότησης από τους φυσιολογικούς ελάσσονες σιαλογόνους αδένες προς τα κακοήθη νεοπλάσματα αποτελεί ισχυρή ένδειξη συμμετοχής στις ογκογόνες διεργασίες του αδενικού επιθηλίου. Απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση για τον καθορισμό mTOR-σχετιζόμενων προγνωστικών δεικτών και θεραπευτικών στόχων που ενδεχομένως λαμβάνουν μέρος στην ογκογένεση των νεοπλασμάτων των σιαλογόνων αδένων