Μελέτη παθογενετικών μηχανισμών ενός νέου προτύπου υπολειπόμενης αυτοσωμικής νευρομυϊκής νόσου στον ποντικό με φαινοτυπική, γενετική και μοριακή ανάλυση

Abstract

Neuromuscular diseases encompass an extremely heterogenous group of clinical entities that remain remain largely incurable causing premature agonizing death while the genetic basis of many of these diseases remains unknown. The above highlight the immediate need for the discovery of genes that play a role in the pathogenesis of these diseases so that the pathogenic mechanisms can be understood and new therapeutic approaches can be invented. In B.S.R.C. “Alexander Fleming” the research group of Dr Eleni Douni identified a novel neuromuscular phenotype using random chemical mutagenesis in the mouse. This novel phenotype clinically involves abnormal limb posture, locomotion defects, tremor, spasticity, muscle weakness, loss of the hind limb extension reflex, cachexia and premature death at the age of one month. This phenotype was designated as spastic and it is an autosomal recessive trait. Histopathologic analysis revealed profound and extensive vacuolation of the motor neurons in the spinal cord and to a lesser extent in the brain. Electron microscopy analysis revealed that these vacuoles were mainly mitochondria that had lost the characteristic infoldings of their inner membrane (cristae).Aim of the present PhD thesis was the phenotypic characterization of this mutant, the genetic mapping of the causal mutation and the molecular and biochemical characterization of the causal gene. Histopathologic analysis revealed profound and extensive vacuolation of the motor neurons in the spinal cord and to a lesser extent in the brain. Electron microscopy analysis revealed that these vacuoles were mainly mitochondria that had lost the characteristic infoldings of their inner membrane (cristae). Apart from the neuromuscular aspect, the spastic phenotype involves lymphoid abnormalities with thymic and splenic atrophy, loss of thymic architecture and changes in the cell subpopulations in the thymus and spleen.Through genetic mapping and sequencing the causal mutation was identified within the novel gene DnaJC11 of the J family of co-chaperones. This is a novel gene, of unknown function that shows very high conservance in vertebrates and is also present in plants and fungi. This mutation is intronic and affects splicing. Specifically, by generating a novel splice acceptor site it results in the incorporation of a 109 bp intronic sequence into the mature transcript causing a frameshift of the last 51 aminoacids of the protein. We showed that this mutation caused an almost complete loss of the protein in most of the tissues examined. Causality of the mutation was confirmed genetically in rescue experiment through expression of the wild type human gene in transgenic mice.DNAJC11 protein has been proposed to be localized in the mitochondrion and that it interacts with proteins of the recently characterized MIB/MICOS complex that is in a great extent responsible for the morphogenesis of the structure of the inner mitochondrial membrane. Using biochemical and fluorescence microscopy techniques we confirmed the mitochondrial localization of DNAJC11, but its loss or overexpression in mutant or transgenic mice did not affect the levels of two core proteins of the MIB/MICOS complex. Data that were produced in the context of a collaboration with a research group at the University of Würzburg, Germany, support the physical and functional relationship of DNAJC11 with the MIB/MICOS complex.In the present PhD thesis, the first mouse mutant for a protein of this complex is described and its functional relationship with a neuromuscular and lymphoid phenotype in the mouse, with possible medical importance, is documented. Further study of this mutant is expected to promote the understanding of the role of mitochondrial structure in neuromuscular diseases and the elucidation of the in vivo physiological role of the MIB/MICOS complex.

Οι νευρομυϊκές ασθένειες αποτελούν μια εξαιρετικά ετερογενή ομάδα κλινικών οντοτήτων που παραμένουν ανίατες σε πολύ μεγάλο βαθμό, προκαλώντας πρόωρο θάνατο, ενώ η γενετική βάση πολλών από αυτές τις ασθένειες παραμένει άγνωστη. Τα δεδομένα αυτά τονίζουν την άμεση ανάγκη για την ανακάλυψη γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια αυτών των ασθενειών, ώστε να κατανοηθούν οι παθογενετικοί μηχανισμοί για την εύρεση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Στο Ε.ΚΕ.Β.Ε. «Αλέξανδρος Φλέμιγκ» η ερευνητική ομάδα της Δρ Ελένης Ντούνη εντόπισε ένα καινούργιο νευρομυϊκό φαινότυπο χρησιμοποιώντας τυχαία χημική μεταλλαξογένεση στο ποντίκι. Ο καινούργιος αυτός φαινότυπος κλινικά περιλαμβάνει ανώμαλη στάση των άκρων, ανώμαλη βάδιση, τρόμο, σπαστικότητα, μυϊκή αδυναμία, απώλεια του αντανακλαστικού της έκτασης των οπίσθιων άκρων, καχεξία και πρόωρο θάνατο στην ηλικία του ενός μήνα. Ο φαινότυπος αυτός ονομάστηκε spastic και είναι αυτοσωμικός υπολειπόμενος με πλήρη διεισδυτικότητα επηρεάζοντας εξίσου και τα δύο φύλα.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός αυτού του νέου μοντέλου, η γενετική χαρτογράφηση της υπεύθυνης μετάλλαξης, ο μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός του εν λόγω γονιδίου. Τα αποτελέσματα της ιστοπαθολογικής ανάλυσης έδειξαν έντονη και εκτεταμένη κενοτοποίωση των κινητικών νευρώνων στο νωτιαίο μυελό και σε μικρότερη έκταση στον εγκέφαλο. Ανάλυση με ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε πως τα κενοτόπια αυτά προέρχονταν κυρίως από μιτοχόνδρια τα οποία έχουν χάσει τις χαρακτηριστικές αναδιπλώσεις των εσωτερικών τους μεμβρανών (cristae). Πέραν του νευρομυϊκού φαινοτύπου ο φαινότυπος spastic περιλαμβάνει λεμφοποιητικές ανωμαλίες με ατροφία του θύμου και του σπλήνα, απώλεια της αρχιτεκτονικής του θύμου, και διαφοροποιήσεις στους υποκυτταρικούς πληθυσμούς του θύμου και του σπλήνα.Μέσω γενετικής χαρτογράφησης και αλληλούχησης η υπεύθυνη σημειακή μετάλλαξη εντοπίστηκε στο γονίδιο DnaJC11 της οικογένειας των συν-συνοδών πρωτεϊνών J. Πρόκειται για ένα καινούργιο γονίδιο, άγνωστης λειτουργίας, το οποίο παρουσιάζει πολύ υψηλή συντήρηση στα σπονδυλωτά ενώ υπάρχει και στα φυτά και τους μύκητες. Η μετάλλαξη είναι εσωνική και επηρεάζει το μάτισμα. Πιο συγκεκριμένα, δημιουργώντας μια νέα θέση δέκτη του ματίσματος προκαλεί την ενσωμάτωση μιας εσωνικής περιοχής μήκους 109 bp στο ώριμο μετάγραφο προκαλώντας μετατόπιση του αναγνωστικού πλαισίου των τελευταίων 51 αμινοξέων. Στο πρωτεϊνικό επίπεδο δείξαμε πως η μετάλλαξη αυτή προκάλεσε την σχεδόν πλήρη απώλεια της πρωτεΐνης στους περισσότερους ιστούς που εξετάστηκαν. Η αιτιότητα της μετάλλαξης αυτής επιβεβαιώθηκε γενετικά σε πειράματα διάσωσης με την έκφραση του αγρίου τύπου ανθρώπινου γονιδίου σε διαγονιδιακά ποντίκια.Η πρωτεΐνη DNAJC11 έχει προταθεί ότι εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο και ότι αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες του προσφάτως χαρακτηρισθέντος συμπλόκου MIB/MICOS το οποίο είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνο για τη διαμόρφωση της δομής της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων. Με τεχνικές βιοχημείας και μικροσκοπίας φθορισμού επιβεβαιώσαμε πως η DNAJC11 εντοπίζεται στο μιτοχόνδριο έχοντας τοπολογία περιφερειακή της εξωτερικής μεμβράνης αλλά η απώλεια ή υπερέκφρασή της στα μεταλλαγμένα ή διαγονιδιακά ποντίκια δεν επηρέασε τα επίπεδα δύο κεντρικών πρωτεϊνών του συμπλόκου MIB/MICOS. Δεδομένα ωστόσο που προέκυψαν από συνεργασία με ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου του Würzburg υποστηρίζουν τη φυσική και λειτουργική συσχέτιση της DNAJC11 με το σύμπλοκο MIB/MICOS.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται το πρώτο μετάλλαγμα ποντικού για το γονίδιο DnaJC11 και καταγράφεται η λειτουργική συσχέτισή του με νευρομυϊκό και λεμφοποιητικό φαινότυπο στο ποντίκι με πιθανή ιατρική σημασία. Η περαιτέρω μελέτη του αναμένεται να προσφέρει στην κατανόηση του ρόλου της μιτοχονδριακής δομής στις νευρομυϊκές ασθένειες και στη διαλεύκανση του in vivo φυσιολογικού ρόλου του συμπλόκου MIB/MICOS.