Μελέτη μοριακών δεικτών στον καρκίνο των ωοθηκών

Abstract

Ovarian cancer is one of the most common types of cancer and the leading cause of death due to gynecological malignancies. It is well established that dense CD8+ T-lymphocyte infiltration within the ovarian tumor masses correlates with favorable prognosis and improved patient survival. Still, the genes and the underlying molecular mechanisms that govern the recruitment and infiltration of T- lymphocytes in ovarian cancer remain quite vague. The aim of the present thesis was to identify genes involved in T-lymphocyte infiltration and to investigate their prognostic value and their role in the recruitment of lymphocytes in early stage ovarian cancer. In an attempt to pinpoint genes involved in CD8+ T-lymphocyte recruitment at the early stages of the disease, we focused in stage I and II ovarian tumors. To this end, a fluorescent Differential Display approach was utilized and 128 genes over-expressed in ovarian tumors with high numbers of CD8+ T-lymphocytes were identified. The expression of a significant number of genes was further evaluated with qPCR in a cohort of 38 early-stage ovarian cancer patients and a significant positive correlation of the mRNA levels of CXCL9, SMARCE1, MEIS1, GPC6, TMEM132D and JAG1 with the expression levels of CD8A, a marker of CD8+ T-lymphocyte infiltration, was documented. Importantly, forced over-expression of the chromatin remodeler SMARCE1 in SKOV3 ovarian cancer cells after transfection enhanced the expression of the chemokines IL8, RANTES and MIP1B and triggered the chemotaxis of CD8+ T-lymphocytes in vitro. Similarly, over-expression of the transcription factor MEIS1 in SKOV3 cells resulted in secretion of the chemokines IL8, GROα, RANTES, MIP1B, PARC and NAP2 and enhanced chemotaxis of CD8+ T-lymphocytes. Furthermore, MEIS1 was able to bind to the above chemokine promoters both in vitro and in vivo as found by Electrophoretic Mobility Shift Assays and Chromatin Immunoprecipitation. Finally, in order to evaluate the prognostic value of the genes identified with the fluorescent Differential Display, a retrospective clinical analysis of the survival of the early-stage ovarian cancer patients was performed. The expression of GPC6 and TMEM132D correlated with the overall survival of the patients and thus the two genes could serve as prognostic markers in early stage ovarian cancer. To sum up, in the present thesis several genes that could be used as markers of CD8+ T-lymphocyte infiltration and with prognostic value in early stage ovarian cancer were identified. Furthermore, two novel mechanisms regulating CD8+ T-lymphocyte recruitment at the tumor masses were demonstrated.

O καρκίνος των ωοθηκών είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου και η σημαντικότερη αιτία θανάτου από γυναικολογικές κακοήθειες. Σύμφωνα με πληθώρα μελετών, η διήθηση CD8+ T-λεμφοκυττάρων στους όγκους ωοθηκών αποτελεί θετικό προγνωστικό δείκτη και συσχετίζεται με αυξημένη επιβίωση των ασθενών. Ωστόσο, δεν έχουν χαρακτηριστεί πλήρως τα γονίδια και οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη στρατολόγηση των Τ-λεμφοκυττάρων στους συμπαγείς όγκους ωοθηκών. Στόχος, λοιπόν, της παρούσας διατριβής ήταν η ταυτοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με τη διήθηση των λεμφοκυττάρων στον καρκίνο ωοθηκών και η μελέτη α) του ρόλου τους σε αυτή τη διαδικασία και β) της προγνωστικής τους αξίας. Για τον εντοπισμό γονιδίων που εμπλέκονται στις αρχικές φάσεις της διήθησης των CD8+ T-λεμφοκυττάρων, επικεντρωθήκαμε σε αρχικού σταδίου καρκινικούς όγκους ωοθηκών. Εφαρμόζοντας μια σύνθετη μέθοδο Διαφορικής Έκθεσης με φθορισμό ταυτοποιήσαμε 128 γονίδια που υπερεκφράζονταν σε όγκους με εκτεταμένη διήθηση CD8+ T-λεμφοκυττάρων. Για ένα σημαντικό αριθμό από αυτά η έκφραση επαληθεύθηκε με ποσοτική PCR σε 38 ασθενείς με καρκίνο ωοθηκών αρχικού σταδίου και παρατηρήθηκε μια θετική και στατιστικά σημαντική συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων CXCL9, SMARCE1, MEIS1, GPC6, TMEM132D, CST3 και JAG1 με τη διήθηση των CD8+ T-λεμφοκυττάρων. Μάλιστα, η υπερέκφραση του παράγοντα αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης SMARCE1 σε κύτταρα της καρκινικής σειράς ωοθηκών SKOV3, ύστερα από διαμόλυνση, είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης των χημειοκινών IL8, RANTES και MIP1B και προκαλούσε τον in vitro χημειοτακτισμό CD8+ T-λεμφοκυττάρων. Επίσης, με ανοσοφθορισμό βρέθηκε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας MEIS1 εκφράζεται σε συγκεκριμένες περιοχές καρκινικών όγκων ωοθηκών με εκτεταμένη διήθηση λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, η υπερέκφραση του MEIS1 σε κύτταρα της καρκινικής σειράς ωοθηκών SKOV3 είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης των χημειοκινών IL8, GROα, RANTES, MIP1B, PARC και NAP2 και προκαλούσε τον χημειοτακτισμό CD8+ T-λεμφοκυττάρων in vitro. Ακόμη, με δοκιμές Μεταβολής Ηλεκτροφορητικής Κινητικότητας και Ανοσοκατακρήμνιση Χρωματίνης ο παράγοντας MEIS1 βρέθηκε ότι προσδένεται in vitro και in vivo στους υποκινητές των παραπάνω χημειοκινών, ενισχύοντας την πιθανότητα να ρυθμίζει άμεσα την έκφρασή τους. Τέλος, αναλύοντας την προγνωστική αξία των γονιδίων που ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο Διαφορικής Έκθεσης, βρέθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης των GPC6 και TMEM132D συσχετίζονται σημαντικά με την ολική επιβίωση των ασθενών και αποτελούν θετικό προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο ωοθηκών αρχικού σταδίου. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη ταυτοποιήθηκαν γονίδια που θα μπορούσαν χρησιμοποιηθούν ως δείκτες πρόγνωσης και διήθησης CD8+ T-λεμφοκυττάρων στον καρκίνο των ωοθηκών και προσδιορίστηκαν δύο νέοι μηχανισμοί ρύθμισης αυτής της διήθησης.