Μικροεπεξεργασία υλικών με λέιζερ στενών παλμών: μελέτη της ανάπτυξης και διεπαφής δικτύων νευρικών κυττάρων σε 3Δ ικριώματα πυριτίου

Abstract

Unlike other tissue types, which consist of cells with a much more homogeneousstructure and function, the nervous tissue spans in a complex multilayer environment whose topographical features display a large spectrum of morphologies and size scales. Because of the necessity of a multilayer environment, the well established flat tissue culture surfaces are proven to be insufficient for studying the effect of the topography of the surroundings on nerve cell morphology and function. In an attempt to approach the complexity of the topographical milieu of nerve cells, it is necessary to shift to more complex 3D micropatterned surfaces. Micro-and nanofabrication techniques provide the opportunity to develop new types of cell culture platform, where the effect of various topographical cues on cellular functions such as proliferation and differentiation can be studied. Different approaches (regarding the material, fabrication technique, cell type and assay) have been used in order to fabricate micropatterned surfaces, where the effect of topography on nerve cell development can be studied. In this study, the cellular growth on micropatterned Si substrates (comprising arrays ofmicrocones -MCs) fabricated by ultra-short pulsed laser processing has been investigated. Using increasing laser uence, three types of micropatterned Si surfaces, which exhibit different geometrical characteristics (denoted as low, medium and high roughness substrates, respectively), have been fabricated and characterized as to surface morphology, wetting properties and surface chemistry. As roughness increases, among the different geometrical characteristics of the MCs, intercone distance increases and an anisotropic topography becomes more pronounced. These three micropatterned Si substrates together with the unpatterned flat Si have been applied to in vitro cell cultures. PC12 cells were used as a model of nerve cells in order to study the NGF-induced growthand differentiation pattern (neuritogenesis) on the micropatterned Si substrates. Upon NGF treatment, cell differentiation was promoted on low and intermediate roughness substrates, whereas it was strongly inhibited on the highly rough ones. The obtained results suggested that the intercone space did effectively inuence the NGF-induced PC12 differentiation fate. Dissociated primary cells of the PNS were used in order to investigate the topographic guidance of neural outgrowth and network formation of dissociated SCG sympathetic neurons as well as the effect of (surface) topography on Schwann cell morphology. It was shown that the neuronal network on the low roughness substrates displayed high randomness, whereas the neurons on intermediate and high roughness substrates exhibited a parallel alignment.Furthermore, oriented Schwann cell outgrowth was promoted on intermediate and highroughness substrates. This surface -induced guidance effect was also observed in the whole DRG explant model, where both Schwann cell migration and axonal outgrowth exhibited a surfacedependent response. In this model, it was shown that Schwann cells create a cellular “carpet” onto the substrates. Neurons were, in turn, outgrown on top of them. It is hypothesized that the plasticity of Schwann cells and their processes allowed a glial “carpet” formation, which served as a substrate for neurite outgrowth. Therefore, it can be concluded that the distinct geometrical characteristics of surfaceroughness could influence a variety of neuronal and neuroglial cell functions. The lasermicropatterned silicon (Si) substrates presented here could potentially be used as model scaffolds for the systematic exploration of the role of 3D microtopography on cell differentiation and neural network outgrowth, where Schwann cell–neuronal interactions could be investigated in the context of nerve tissue regeneration.

Σε αντίθεση με τους υπόλοιπους ιστούς, οι οποίοι αποτελούνται από κύτταρα πιο ομοιογενή σε δομή και λειτουργία, ο νευρικός ιστός εκτείνεται σε ένα πολύπλοκο και πολυεπίπεδο περιβάλλον, του οποίου τα τοπογραφικά χαρακτηριστικά επιδεικνύουν ένα μεγάλο φάσμα μορφολογιών και μεγεθών. Εξαιτίας της σημασίας ενός τέτοιου περιβάλλοντος, τα συνήθη επίπεδα υποστρώματα καλλιέργειας κυττάρων αποδεικνύονται ανεπαρκή για τη μελέτη της επίδρασης της τοπογραφίας του περιβάλλοντος στην μορφολογία και την λειτουργία των νευρικών κυττάρων. Συνεπώς, για να προσεγγίσουμε την πολυπλοκότητα του τοπογραφικού περιβάλλοντος των νευρικών κυττάρων, είναι απαραίτητο να μεταβούμε σε πιο πολύπλοκες 3Δ μικροδομημένες επιφάνειες. Μέσω των τεχνικών μικρο- και νανο-κατεργασίας, μπορούν να αναπτυχθούν νέου τύπου πλατφόρμες καλλιέργειας κυττάρων, στις οποίες μπορεί να μελετηθεί η επίδραση των διαφόρων τοπογραφικών σινιάλων στις κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση. Διάφορες προσεγγίσεις, αναφορικά με το υλικό, το είδος της τεχνικής, τον τύπο του κυττάρου, κτλ., έχουν αναπτυχθεί για την κατασκευή μικροδομημένων επιφανειών, όπου μπορεί να μελετηθεί η επίδραση της τοπογραφίας στην ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η κυτταρική ανάπτυξη πάνω σε μικροδομημένα υποστρώματα πυριτίου (τα οποία αποτελούνται από διατάξεις μικροκώνων) και τα οποία κατασκευάστηκαν με την τεχνική της δόμησης με λέιζερ υπέρστενων παλμών. Αυξάνοντας την πυκνότητα ενέργειας του λέιζερ, κατασκευάστηκαν τρία είδη μικροδομημένων επιφανειών πυριτίου, οι οποίες επιδεικνύουν διαφορετικά γεωμετρικά χαρακτηριστικά (διαβαθμισμένες σε τρεις κατηγορίες χαμηλής, μεσαίας και υψηλής ονομαστικής τραχύτητας). Οι μικροδομημένες επιφάνειες χαρακτηρίστηκαν αναφορικά με την επιφανειακή τους μορφολογία, τις ιδιότητες διαβροχής και την επιφανειακή τους χημεία. Όσο αυξάνεται η τραχύτητα, η απόσταση μεταξύ των κώνων αυξάνεται και η ανισοτροπία της μορφολογίας γίνεται εμφανέστερη. Αυτά τα τρία μικροδομημένα υποστρώματα χρησιμοποιήθηκαν μαζί με επίπεδο πυρίτιο, σε in vitro πειράματα με κύτταρα. Τα PC12 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένα μοντέλο νευρικών κυττάρων, με σκοπό ναερευνηθεί η επαγόμενη από τον NGF ανάπτυξη και διαφοροποίηση (νευριτογένεση) πάνω στα μικροδομημένα υποστρώματα πυριτίου. Κατόπιν χορήγησης NGF, η κυτταρική διαφοροποίηση ενθαρρύνθηκε στα υποστρώματα χαμηλής και ενδιάμεσης τραχύτητας, ενώ ανεστάλη σε εκείνα της υψηλής τραχύτητας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απόσταση μεταξύ των κώνων επηρεάζει αποτελεσματικά την μοίρα διαφοροποίησης των PC12 κυττάρων. Πρωτογενή κύτταρα του περιφερικού νευρικού συστήματος χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθεί η τοπογραφική καθοδήγηση στην νευρική ανάπτυξη και την ανάπτυξη νευρικούδικτύου συμπαθητικών νευρώνων, καθώς επίσης και η επίδραση της (επιφανειακής)τοπογραφίας στην μορφολογία των κυττάρων Schwann. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τονευρικό δίκτυο στα υποστρώματα χαμηλής τραχύτητας ήταν τυχαίου προσανατολισμού, ενώ οι νευρώνες στα υποστρώματα ενδιάμεσης και υψηλής τραχύτητας επιδείκνυαν παράλληλη ευθυγράμμιση. Επιπλέον, στα υποστρώματα ενδιάμεσης και υψηλής τραχύτητας ενθαρρύνθηκε η προσανατολισμένη ανάπτυξη των κυττάρων Schwann. Ανάλογο φαινόμενο επιφανειακά επαγόμενης κατευθυντικότητας παρατηρήθηκε και στο μοντέλο του ολόκληρου γαγγλίου, όπου τόσο η μετανάστευση των κυττάρων Schwann όσο και αξονική ανάπτυξη επιδείκνυαν μια απόκριση εξαρτώμενη από την επιφάνεια του υποστρώματος. Σε αυτό το μοντέλο, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα Schwann δημιουργούν ένα είδος κυτταρικού “τάπητα” πάνω στα μικροδομημένα υποστρώματα. Οι νευρώνες αναπτύσσονταν πάνω σε αυτά. Διατυπώνεται η υπόθεση ότι η πλαστικότητα των κυττάρων Schwann και των απολήξεών τους επέτρεψε τον σχηματισμό ενός νευρογλοιακού “τάπητα”, ο οποίος αποτέλεσε υπόστρωμα για την νευριτική ανάπτυξη. Συνεπώς, συμπεραίνεται ότι τα συγκεκριμένα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της επιφανειακής τραχύτητας μπορούν να επηρεάσουν ένα εύρος νευρικών και νευρογλοιακών κυτταρικών λειτουργιών. Τα μικροδομημένα υποστρώματα πυριτίου που κατασκευάζονται με χρήση λέιζερ και παρουσιάζονται με την παρούσα εργασία, θα μπορούσαν εν δυνάμει να χρησιμοποιηθούν ως πρότυπα ικριώματα για την συστηματική διερεύνηση του ρόλου της 3Δ μικροτοπογραφίας στην κυτταρική διαφοροποίηση και ανάπτυξη νευρικών δικτύων, όπου οι αλληλεπιδράσεις των κυττάρων Schwann με τους νευρώνες θα μπορούσαν να ερευνηθούν αναφορικά με την αναγέννηση του νευρικού ιστού.