Ανάπτυξη εμπεδησιομετρικών βιοαισθητήρων και βιοαισθητήρων συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύνα...

Abstract

Cheese production is relied upon the action of rennet (a mixture of chymosin and pepsin) onto casein micelles of milk. For the first time, the monitoring of this interaction with Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) was used to develop a faradic impedimetric biosensor for the assessment of the clotting activity of rennet, using hexacyanoferrate(II)/(III) couple as a redox probe. Gold electrodes were modified with self-assembled monolayers of different thiols (thioctic acid, dithiobis−N−succinimidyl propionate and cysteamine), and (artificial) casein micelles were immobilized on the modified gold surfaces. The proposed method is based on the measurement of charge–transfer resistance (Rct) changes attributed to the degradation of the negatively charged immobilized casein micelles by rennet to neutral biostructures. This action results in the increase of the flux of the redox probe, which exists in the bulk solution, to the surface of the electrode and, consequently, in the decrease of Rct. Experimental parameters such as the micelle loading, the reaction time, the concentration of rennet and the working pH, were optimized. Besides EIS measurements, cyclic voltammetry, FT−IR, and AFM experiments were also performed before and after the interaction of the immobilized micelles with rennet. Finally, the proposed biosensors were successfully tried to various commercial samples

Thesis also describes the development of kappa−casein (k−CN)−based electrochemical and surface plasmon resonance (SPR) biosensors for the assessment of the clotting activity of rennet. Electrochemical biosensors were developed over gold electrodes modified with a self-assembled monolayer of dithiobis−N−succinimidyl propionate, while SPR measurements were performed on regenerated carboxymethylated dextran gold surfaces. In both type of biosensors, k−CN molecules were immobilized onto modified gold surfaces through covalent bonding. In electrochemical biosensors, interactions between the immobilized k−CN molecules and chymosin (the active component of rennet) were studied by performing cyclic voltammetry, differential pulsed voltammetry, and electrochemical impedance spectroscopy measurements, using hexacyanoferrate(II)/(III) couple as a redox probe. k−CN is cleaved by rennet at Phe105−Met106 bond, producing a soluble glycomacropeptide, which released to the electrolyte, and the positively charged (pI>7) insoluble para-k-casein molecule, which remain attached to the surface of the electrode. The so induced reduction of the net negative charge of the sensing surface, along with the partial degradation of the sensing layer, results in an increase of the flux of the redox probe, which exist in the solution, and consequently, to signal variations, which are associated with the increased electrocatalysis of the hexacyanoferrate(II)/(III) couple on the gold surface. SPR experiments were performed in the absence of the redox probe and the observed SPR angle alterations are solely attributed to the structural changes of the sensing layer. Various experimental variables were investigated and under the selected conditions the proposed biosensors were successfully tried for various commercial powder or liquid samples.

Στο 10 κεφάλαιο της παρούσας διατριβής περιγράφεται η ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύναμης της πυτιάς. Η κατασκευή των βιοαισθητήρων βασίστηκε στην ακινητοποίηση συνθετικών μικκυλίων καζεΐνης (ACM, artificial casein micelles) πάνω στην επιφάνεια ηλεκτροδίων χρυσού, που αρχικά τροποποιήθηκαν με αυτοδιατασσόμενες μονοστιβάδες διαφόρων θειολών (self−assembled monolayers, SAMs) (θειοκτικό οξύ, δις− (Ν−υδροξυηλεκτριμιδυλο)−διθειοδιπροπιονικός εστέρας και κυστεαμίνη) και στη συνέχεια εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα πυτιάς. Η μέθοδος βασίζεται στη μεταβολή της αντίστασης μεταφοράς φορτίου (Rct, charge−transfer resistance) της διεπιφάνειας των ηλεκτροδίων Au/θειόλη/ACM με το διάλυμα του ηλεκτρολύτη, παρουσία του οξειδοαναγωγικού ζεύγους σιδηρι−∕σιδηροκυανιούχων ιόντων. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των ακινητοποιημένων ACM με τη χυμοσίνη είχε ως αποτέλεσμα την αποδόμηση των αρνητικά φορτισμένων μικκυλίων και τη μετατροπή τους σε ουδέτερες βιοδομές, οδηγώντας έτσι σε αύξηση της ροής του οξειδοαναγωγικού ζεύγους από το διάλυμα του ηλεκτρολύτη στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί στη μείωση της Rct.. Οι παράμετροι που βελτιστοποιήθηκαν αφορούσαν στη συγκέντρωση των μικκυλίων, στο χρόνο αντίδρασης, στη συγκέντρωση της πυτιάς και στο pH του διαλύματος εργασίας. Πέραν των πειραμάτων φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης (Εlectrochemical Impedance Spectroscopy, ΕIS) πραγματοποιήθηκαν και πειράματα κυκλικής βολταμμετρίας (Cyclic Voltammetry, CV), φασματοσκοπίας υπερύθρου (Fourier Transform, Infrared Spectroscopy, FT−IR), μικροσκοπία ατομικής δύναμης (Atomic Force Microscopy, AFM), μικροσκοπία ηλεκτρoνιακής σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM) και μικροζυγού κρυστάλλου χαλαζία (Quartz Crystal Microbalance, QCM), πριν και μετά την αντίδραση με πυτιά. Τέλος, οι παραπάνω βιοαισθητήρες χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύναμης της πυτιάς σε εμπορικά σκευάσματα στερεής ή υγρής πυτιάς. Από τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με την προτεινόμενη μέθοδο ως προς αυτά της μεθόδου αναφοράς, η οποία βασίζεται στη οπτική παρατήρηση της πήξης του γάλακτος, προκύπτει ότι η μεταβολή της αντίστασης μεταφοράς φορτίου είναι ανάλογη της πηκτικής δύναμης της πυτιάς. Στο δεύτερο κεφάλαιο της διατριβής περιγράφεται η ανάπτυξη ηλεκτροχημικών και οπτικών (SPR) βιαισθητήρων κ−καζεΐνης (k−CN) για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύναμης της πυτιάς. Οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες αναπτύχθηκαν πάνω σε ηλεκτρόδια χρυσού, τα οποία είχαν τροποποιηθεί με DTSP, ενώ οι βιοαισθητήρες SPR πάνω σε επιφάνειες χρυσού τροποποιημένες με καρβοξυμεθυλιομένη δεξτράνη. Και στους δύο τύπους βιοαισθητήρων, η κ−καζεΐνη, ακινητοποιήθηκε με χημικό τρόπο πάνω στις επιφάνειες χρυσού. Στους ηλεκτροχημικούς βιοαισθητήρες οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ακινητοποιημένων μορίων της κ−καζεΐνης και της χυμοσίνης (το δραστικό ένζυμο της πυτιάς), μελετήθηκε με μετρήσεις κυκλικής βολταμμετρίας (Cyclic Voltammetry,CV), παλμικής διαφορικής βολταμμετρίας (Differential Pulse Voltammetry, DPV) και φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης (Electrochemical Impedance Spectrometry, EIS). Όλες οι προαναφερθείσες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν παρουσία ισομοριακού μίγματος σιδηρι−/σιδηροκυανιούχων ιόντων στο διάλυμα μέτρησης. Όμοια με όσα αναφέρθηκαν στο 10 πειραματικό κεφάλαιο κατά την αντίδραση της κ−καζεΐνης με την πυτιά, διασπάται ο δεσμός Phe105−Met106, στο μόριο της κ−καζεΐνης, παράγοντας το διαλυτό γλυκομακροπεπτίδιο, το οποίο απομακρύνεται στο διάλυμα του ηλεκτρολύτη και τη θετικά φορτισμένη (pI>7) αδιάλυτη para κ−καζεΐνη, η οποία παραμένει στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Η μείωση του αρνητικού φορτίου, πάνω στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα, σε συνδυασμό με τη μερική χημική αποδόμηση της στιβάδας αναγνώρισης, έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της ροής του οξειδοαναγωγικού ζεύγους, από το διάλυμα του ηλεκτρολύτη στην επιφάνεια του χρυσού και συνεπώς την αύξηση της ηλεκτροκατάλυσης του οξειδοαναγωγικού ζεύγους στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου. Τα πειράματα SPR πραγματοποιήθηκαν απουσία του οξειδοαναγωγικού ζεύγους ενώ οι παρατηρούμενες μεταβολές στη γωνία συντονισμού των επιφανεικών πλασμονίων οφείλονται στη μεταβολή της μάζας της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης. Μετά τη βελτιστοποίηση των πειραματικών παραμέτρων οι παραπάνω βιοαισθητήρες χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία για τον προσδιορισμό της πηκτικής δύναμης της πυτιάς σε πραγματικά δείγματα στερεής και υγρής μορφής.