Ημερήσιο βιολογικό ρολόϊ κα ακετυλίωση ιστονών: μελέτη της αλληλεπίδρασης τους με τον κυτταρικό κύκλο σε in vitro συστήματα κυττάρων ποντικού

Abstract

Circadian rhythms in biological functions are observed in a wide range of organisms. They are defined as rhythmic oscillations in physiological, metabolic and behavioral processes that are regulated by the circadian clock and display a period of about 24 hours. Central to the function of the circadian clock is the circadian oscillator, which is set by environmental time cues, but keeps circadian time in their absence. The mammalian circadian system is organized in a hierarchy of oscillators. At the top of this hierarchy is the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The SCN is responsible for coordinating peripheral oscillators so that a coherent rhythm is orchestrated at the organismal level. The clock mechanism in the SCN and the peripheral oscillators is known to be similar at the molecular level and consists of a network of transcriptional/translational feedback loops. In vitro culture systems also exhibit circadian rhythms in gene expression, identical to those observed in vivo. In addition to controlling rhythmic expression of core clock components, these loops drive rhythmic expression of “output” genes that control physiological, metabolic and behavioral rhythms. As core clock components are defined genes, the protein products of which are necessary for generation and regulation of circadian rhythms within individual cells. In the primary feedback loop, the positive elements include transcription factors, CLOCK and BMAL1 that heterodimerize. These dimers initiate transcription of target genes containing E-box sequences in their promoters, including Per1, 2 and Cry1, 2. Negative feedback is achieved by PER/CRY dimers that translocate to the nucleus to repress their own transcription, by acting on the CLOCK/BMAL1 complex. Chromatin structure is known to determine its function. Transcriptional activation and repression are typically associated with chromatin modification. The acetylation state of a given chromatin locus is controlled by two classes of antagonizing histone modifying enzymes, histone acetyltransferases (HATs) and deacetylases (HDACs), which add or remove acetyl groups to/from target histones, respectively. Within the circadian oscillator, histone acetylation status has been found to be determining transcriptional 21 activity of positive elements, since rhythmic activation of several BMAL1/CLOCK target genes occurs in parallel with histone acetylation. Histones H3 and H4 in the promoters of Per1, 2 and Cry1 are rhythmically acetylated and maximal acetylation is observed when these genes are actively transcribed. Clock synchronization is achieved via Per1 acute response, a short and rapid induction of its transcription that is enhanced by elevated histone acetylation in its promoter. Rhythmic histone acetylation is mediated by transcriptional coactivators with HAT activity that physically interact with CLOCK. Recently, CLOCK was found to possess intrinsic HAT activity. Circadian clock function is implicated in cell cycle progression in vivo and in vitro. Since clock deregulation has been associated with increased tumor incidents and expression of Per1,2 genes is greatly reduced in several cancers, core clock components are regarded as tumor suppressors. Among circadian “output” genes are many key regulators of cell proliferation, such as Wee1 and c-Myc. The proto-oncogene c-Myc, that mediates the entry of cells in the cell cycle as well as the G1/S transition, is the only known gene, whose expression is negatively regulated by the positive clock elements BMAL1/CLOCK. However, the molecular mechanism by which circadian expression of c-Myc is achieved has not been unraveled. The bibliographic data presented above suggest that circadian clock and cell proliferation are tightly coupled. Therefore, the aim of this thesis was a) to unravel whether the c-Myc products (transcripts and protein) are under circadian clock control in cancerous cells (neuroblastoma) and b) to investigate whether circadian time is important for modulating the effects of trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor that is known to suppress c-Myc and to constitute the basis of potential anticancer regimens. The studies were conducted in a murine neuroblastoma line, N2A. Cell cultures were clock-synchronized and expression of circadian genes was monitored for 48 hours after rhythm induction. Core clock components Bmal1, Per1,2 and Cry1 were found to oscillate with phase-differences identical to those reported for in vivo systems. Cell cycle genes Wee1 and c-Myc were also found to oscillate, indicating that in this cellular context, clock-controlled cell cycle genes function in analogy to the in vivo systems. Moreover, although Per1 is induced and c-Myc is down-regulated by positive clock elements BMAL1/CLOCK, they were found to oscillate in phase, indicating that clock 22 regulates c-Myc by additional mechanism(s) and possibly at multiple levels. To investigate this, protein levels of c-MYC were analyzed in synchronized N2A cultures. Protein accumulation was found, for the first time, to oscillate. In addition, by the use of specific inhibitors of protein synthesis and degradation, it was shown that the oncoprotein is synthesized and degraded following a rhythmic pattern. Since c-MYC acetylation regulates its stability, the acetylation pattern of the protein was analyzed in two opposite rhythmic phases. Our results showed that maximum acetylation is observed at maximum protein levels, suggesting that the balance between acetylation/deacetylation of c-MYC is regulated in a circadian manner. Rhythmic deacetylation is most likely to occur via SIRT1, a NAD-dependent deacetylase whose enzymatic activity has been proven to be controlled by the clock and to deacetylate c-MYC. Taking advantage of TSA’s properties in inducing Per1 expression and in reducing c-Myc levels, N2A cultures were treated with this histone deacetylase inhibitor at two distinct circadian times, representing the peak and the trough of Per1 and c-Myc rhythms. As expected, a 2-hour TSA treatment induced the acute response of Per1. However, a phase difference (phase-advance) of the newly induced Per1 rhythm was observed only when TSA was applied at the trough of the rhythm, indicating that TSA effects are phasedependent. Accordingly, at this specific time point only, c-Myc expression was phaseshifted and down-regulated for about 24 hours. At the same circadian time, c-MYC protein levels were profoundly reduced by TSA treatment and became arrhythmic afterwards, while they were not affected at the opposite circadian time. In nonsynchronized cultures, this reduction could be achieved only after prolonged TSA treatment. With respect to cell cycle progression, c-MYC reduction at this circadian time correlated with reduced proliferation rate of N2A cells accompanied by G1 arrest. Finally, the significance of CLOCK’s HAT activity in up-regulating Per1 and down-regulating c-Myc was explored by reporter gene assays, using wild type CLOCK or a mutated protein, lacking HAT activity. These experiments clearly demonstrated that HAT activity of CLOCK enhances Per1 induction but is dispensable for c-Myc repression by the BMAL1/CLOCK complex. They also suggest that clock transcription factors exert their effect on the oncogene by recruiting so far unknown co-factors and 23 more specifically co-repressors. Best candidates are histone deacetylases, since many of them have been shown to interact with clock elements, e.g. SIRT1. In summary, in the present thesis: a) It was presented for the first time that circadian clock regulates proto-oncogene c-Myc not only at the transcriptional level but also with respect to protein accumulation and stability. b) It was shown that effects of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A on c-Myc mRNA and protein expression are phase-dependent, as well as that c-MYC prolonged reduction after TSA application at specific circadian time correlates with cell cycle arrest of neuroblastoma cells. c) It was indicated that positive clock elements require additional factors in order to suppress c-Myc transcription and that HAT activity of CLOCK is not involved in this mechanism. All data presented point out that the interaction between circadian clock and cell division and cancer has many yet unexplored aspects. A better understanding of the clock function on the regulation of the proto-oncogene c-Myc could be a first step in the development of new strategies to prevent and treat human malignancy.

Σε όλους τους οργανισμούς λαμβάνουν χώρα βιολογικές λειτουργίες που εμφανίζουν κυκλική διακύμανση με περίοδο 24 περίπου ωρών. Οι διακυμάνσεις αυτές καλούνται ημερήσιοι βιολογικοί ρυθμοί και αφορούν στην προσαρμογή των οργανισμών με τη εξωτερική φωτοπερίοδο. Η περιοδικότητα επιτυγχάνεται χάρη σε έναν ενδογενή μηχανισμό μέτρησης του χρόνου, το βιολογικό ρολόι, που τους επιτρέπει να προγραμματίζουν τη δραστηριότητα τους και να αναμένουν τις επερχόμενες εναλλαγές ημέρας/νύχτας. Για την περιγραφή του μοριακού μηχανισμού του ρολογιού χρησιμοποιείται ο όρος ταλαντωτής. Κάθε κύτταρο διαθέτει τον δικό του αυτόνομο ταλαντωτή. Αυτός στηρίζεται στη ρυθμική έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι αναστέλλουν τη μεταγραφή τους. Η παρεμπόδιση εξασκείται έμμεσα, μέσω αναστολής των ενεργοποιητών τους. Αποτέλεσμα είναι η δημιουργία 24ωρων ταλαντώσεων στα επίπεδα μεταγραφής-μετάφρασης αυτών των παραγόντων που συνιστούν τα στοιχεία του ταλαντωτή. Στα θηλαστικά, επικρατεί μια ιεραρχία μεταξύ του κεντρικού ταλαντωτή, ο οποίος εδράζεται στον υπερχιασματικό πυρήνα του εγκεφάλου και των περιφερειακών, που απαντώνται σε επίπεδο ιστού και κυττάρων. Ο κεντρικός ταλαντωτής παράγει αυτόνομα ρυθμικά σήματα ώστε να συγχρονίζονται οι περιφερειακοί ταλαντωτές, ενώ ο ίδιος συγχρονίζεται από εξωτερικά ερεθίσματα. Τα διάφορα ρυθμικά φαινόμενα σε επίπεδο οργανισμού, επομένως, προκύπτουν αθροιστικά από τον παρόμοιο τρόπο δράσης των ταλαντωτών όλων των κυττάρων. Η ρυθμικότητα μεταδίδεται και σε γονίδια που αποτελούν στόχους των στοιχείων του ταλαντωτή Τα στοιχεία του ταλαντωτή των θηλαστικών διακρίνονται σε θετικά και αρνητικά. Τα προϊόντα των γονιδίων Clock και Bmal1 αποτελούν τα θετικά, καθώς επάγουν – ως διμερές – την έκφραση όλων των υπολοίπων γονιδίων του ρολογιού. Τα προϊόντα των γονιδίων Per 1,2 και Cry 1,2 ετεροδιμερίζονται και καταστέλλουν τη δράση του συμπλόκου BMAL1/CLOCK – συνιστούν, δηλαδή, τα αρνητικά στοιχεία Ρυθμική έκφραση των στοιχείων του ταλαντωτή παρατηρείται και σε in vitro συστήματα καλλιεργειών. Ο συγχρονισμός, στην περίπτωση αυτή, επιτυγχάνεται μέσω ουσιών που επάγουν την ταχύτατη αύξηση και τη μετέπειτα ραγδαία μείωση των 17 επιπέδων μεταγραφής του γονιδίου Per1, φαινόμενο που είναι γνωστό ως οξεία απόκριση, η οποία παρατηρείται και in vivo και είναι ενδεικτική του επανασυγχρονισμού του ρολογιού. Πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης των στοιχείων του ταλαντωτή διαδραματίζει η αναδιάταξη της χρωματίνης στους υποκινητές τους. Είναι γνωστό πως η ακετυλίωση των ιστονών δημιουργεί τις προϋποθέσεις για την έναρξη της μεταγραφής. Ειδικά για τα Ρer 1,2 και Cry1 έχει βρεθεί ότι ο βαθμός ακετυλίωσης των ιστονών στους υποκινητές τους παρουσιάζει ρυθμικότητα σύμφωνη με τα επίπεδα των mRNAs αυτών. Αύξηση της ακετυλίωσης στις ιστόνες Η3 και Η4 του Per1 υποκινητή συνοδεύεται από την οξεία απόκριση του γονιδίου. Η ρυθμική ακετυλίωση/αποακετυλίωση των ιστονών ελέγχεται από τη ρυθμική στρατολόγηση παραγόντων με ενεργότητα ακετυλο- μεταφοράσης (ΗΑΤ) και αποακετυλάσης αντίστοιχα από τα στοιχεία του ταλαντωτή. Ενδογενή ενεργότητα ΗΑΤ διαθέτει και η ίδια η πρωτεΐνη CLOCK, που μάλιστα επάγεται από την αλληλεπίδρασή της με την BMAL1. Μεταξύ των γονιδίων-στόχων των στοιχείων του ταλαντωτή εντοπίζονται αυτά που κωδικοποιούν για τους ρυθμιστές της προόδου του κυτταρικού κύκλου, την κινάση WEE1 (μετάβαση G2-M) και την ογκο-πρωτεΐνη c-MYC (μετάβαση G0-G1). Το c-Myc είναι το μοναδικό γονίδιο η έκφραση του οποίου καταστέλλεται από τα θετικά στοιχεία του ταλαντωτή. Ο μηχανισμός μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η καταστολή, ωστόσο, δεν έχει διερευνηθεί. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι τα γονίδια του ρολογιού είτε υποεκφράζονται είτε παρουσιάζουν αλλοιώσεις στην ταλαντούμενη έκφρασή τους σε πολλούς τύπους καρκίνου. Τα παραπάνω συνηγορούν υπέρ μιας δυναμικής σχέσης ανάμεσα στη λειτουργία του ρολογιού και στην ανάπτυξη καρκινικών όγκων. Με αφορμή το συσχετισμό του βιολογικού ρολογιού με την κυτταρική διαίρεση και επομένως και με την καρκινογένεση (κυρίως μέσω του c-Myc), στα πλαίσια της παρούσας διατριβής έγινε μελέτη της ρυθμικής έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού και των ρυθμιζόμενων από το ρολόι Wee1 και c-Myc, στην καρκινική σειρά ποντικού Ν2Α. Η ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων αυτών έδειξε ότι στην καλλιέργεια τα επίπεδα mRNA τους εμφανίζουν ρυθμικές μεταβολές αντίστοιχες με αυτές που συμβαίνουν και in vivo. Παράλληλα, από την μελέτη της έκφρασης των c-Myc και Wee1 προέκυψε ότι αυτά εκφράζονται ρυθμικά σε συγχρονισμένες καλλιέργειες Ν2Α, γεγονός που αποδεικνύει ότι 18 τα στοιχεία του ρολογιού εξακολουθούν να ελέγχουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων τους. Από την ανάλυση της έκφρασης των Per1 και c-Myc προέκυψε ότι εμφανίζουν ρυθμικότητα ίδιας φάσης, γεγονός μη αναμενόμενο, διότι το Per1 επάγεται ενώ το c-Myc καταστέλλεται από το σύμπλοκο BMAL1/CLOCK. Αυτό υποδεικνύει ότι η ρύθμιση του c-Myc από το ρολόι δεν περιορίζεται στην καταστολή του υποκινητή του, καθώς σε αυτή την περίπτωση οι φάσεις μεταξύ των Per1 και c-Myc θα ήταν αντίθετες. Για τη διερεύνηση των επιπλέον μηχανισμών ελέγχου του ογκογονιδίου από το ρολόι έγινε ανάλυση και των επιπέδων συσσώρευσης της πρωτεΐνης c-MYC. Για πρώτη φορά διαπιστώθηκε ότι αυτά μεταβάλλονται επίσης ρυθμικά. Με τη χρήση ειδικών αναστολέων της πρωτεϊνοσύνθεσης και της αποικοδόμησης πρωτεϊνών, αποδείχτηκε ότι η ρυθμικότητα στη συσσώρευση της c-MYC οφείλεται στη ρυθμικά μεταβαλλόμενη σύνθεση και σταθερότητά της. Αναφορικά με τη σταθερότητά της, επειδή αυτή καθορίζεται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, διερευνήθηκε ο βαθμός ακετυλίωσης της πρωτεΐνης. "ιαπιστώθηκε ότι αυτός είναι μεγαλύτερος κατά τη χρονική στιγμή όπου και τα επίπεδα συσσώρευσης της c-MYC παρουσιάζουν μέγιστο. Αυτό αποτελεί ένδειξη ότι το ρολόι ελέγχει το ρυθμό αποικοδόμησής της, πιθανόν μέσω της αποακετυλάσης SIRT1, η ενεργότητα της οποίας ελέγχεται από το ρολόι. Στη συνέχεια, με στόχο τη γενική μείωση των επιπέδων έκφρασης του ογκογονιδίου c-Myc, χορηγήθηκε ένας αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, στο μέγιστο και στο ελάχιστο του ρυθμού. Χρησιμοποιήθηκε η τριχοστατίνη Α (TSA) επειδή ήταν ήδη γνωστό ότι παρατεταμένη χρήση της μειώνει τα επίπεδα του c-Myc, ενώ χορήγησή της σε καλλιέργειες, για 2 ώρες, επιφέρει την οξεία απόκριση του Per1. Από την ανάλυση των επιπέδων της ρυθμικής έκφρασης των Per1 και c-Myc φάνηκε ότι το αποτέλεσμα της 2ωρης χορήγησης TSA στην έκφραση των δύο γονιδίων διαφοροποιείται ανάλογα με τον χρόνο της εφαρμογής. Το πλέον εντυπωσιακό είναι ότι το TSA προκαλεί μεταβολή στη φάση του ρυθμού και παρατεταμένη ελάττωση των συνολικών επιπέδων του c-Myc μόνο όταν εφαρμοστεί στη χρονική στιγμή που η μεταγραφή του σημειώνει ελάχιστο. Επιπλέον, στον ίδιο χρόνο διαπιστώθηκε σημαντική ελάττωση στα επίπεδα της πρωτεΐνης c-MYC, η οποία συνοδεύτηκε και από απώλεια της ρυθμικότητας. Η μελέτη της κατανομής των κυττάρων σε κάθε μία από τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου έδειξε 19 ότι η ελάττωση των επιπέδων της c-MYC, λόγω της χορήγησης TSA στη συγκεκριμένη φάση του ρυθμού, επιφέρει αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε καλλιέργειες-μάρτυρες, όπου τα επίπεδα συσσώρευσης της πρωτεΐνης δεν μεταβάλλονται ρυθμικά, αντίστοιχη αναστολή απαιτεί μεγαλύτερης διάρκειας επώαση με TSA. Τέλος, με σκοπό την κατανόηση του ρόλου της ΗΑΤ ενεργότητας της CLOCK στην ρύθμιση της έκφρασης των Per1 και c-Myc, μελετήθηκε η ικανότητα επαγωγής του Per1 και καταστολής του c-Myc από μια μεταλλαγμένη πρωτεΐνη CLOCK, χωρίς ενεργότητα ΗΑΤ. Έτσι, αποδείχτηκε ότι η ΗΑΤ ενεργότητα της CLOCK απαιτείται μεν για την επαγωγή του Per1 αλλά όχι για την καταστολή του c-Myc. Αυτό υποδηλώνει ότι το διμερές BMAL1/CLOCK πιθανότατα στρατολογεί καταστολείς για την ανασταλτική του δράση στον υποκινητή του c-Myc. Η υπόθεση αυτή συμφωνεί και με δεδομένα άλλων εργασιών που πιθανολογούν ότι πολλαπλοί παράγοντες με δράση αποακετυλάσης στρατολογούνται στον υποκινητή του ογκογονιδίου. Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία: Α. διαπιστώθηκε ότι ρυθμικότητα παρουσιάζει όχι μόνο η έκφραση του ογκογονιδίου c-Myc, αλλά και τα επίπεδα συσσώρευσης της πρωτεΐνης του, καθώς και ο βαθμός ακετυλίωσης αυτής, που σχετίζεται με τη σταθερότητά της. Β. αποδείχτηκε ότι η αλλαγή των ενδοκυττάριων επιπέδων ακετυλίωσης, με τη χρήση της τριχοστατίνης Α - ενός αναστολέα των αποακετυλασών των ιστονών - επιφέρει καταστολή της έκφρασης της c-MYC και ανάσχεση της προόδου του κυτταρικού κύκλου μόνο όταν λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένη φάση του ρυθμού. Γ. παρουσιάστηκαν στοιχεία ότι η καταστολή του c-Myc υποκινητή από το ρολόι προϋποθέτει τη στρατολόγηση επιπλέον παραγόντων από τα στοιχεία του ταλαντωτή. Τα αποτελέσματα αυτά ανοίγουν νέους δρόμους στην έρευνα της ρύθμισης του ογκογονιδίου c-Myc από το ημερήσιο βιολογικό ρολόι και υποδεικνύουν καινούργιες προοπτικές στη χρονοεξαρτώμενη καταπολέμηση του καρκίνου.