Επίδραση της αναστολής της κυκλοοξυγενάσης-2 στην αναστόμωση του παχέος εντέρου σε επίμυες

Abstract

Cyclooxygenase (COX) is an enzyme which catalyzes the conversion of arachidonic acid into prostaglandin derivatives. Two isoforms of COX have been identified, COX-1, which is constitutively expressed and COX-2, which is expressed in response to external stimuli and is postulated to be mainly involved in pathologic conditions such as inflammation, pain and fever. Based on these findings, a new group of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDs) emerged, the coxibs. The members of this group of drugs allow specific targeting of the inflammatory disease processes mediated by COX-2, without the disruption of normal homeostatic mechanisms which are mediated by COX-1. Numerous side effects previously assigned to NSA1D therapy such as gastric ulceration and increased bleeding tendency can be avoided. Recent evidence shows that selective COX-2 inhibitors exhibit antiangiogenic activity and are consequently used as chemoprevention against specific cancer types. The tissue healing process is also directly related to angiogenesis. Healing of intestinal anastomoses is of special interest to the surgeon because impaired healing of the anastomosis may lead to life threatening anastomotic dehiscence. The present study investigates whether COX-2 inhibition by celecoxib impairs the healing of colonic anastomosis in rats. Seventy two male Wistar rats were randomly assigned into two major groups (36 rats each), the study group and the control group. Each group was further divided into two subgroups (18 rats each) depending on the day of sacrifice (3rd or 7th postoperative day). All rats underwent anesthesia, laparotomy, resection of 1 cm of large intestine from a point approximately 3 cm proximal to the peritoneal reflection and construction of an end-to-end anastomosis using 6-8 inverting polypropylene 6/0 sutures. Celecoxib 10mg/kg body weight once daily was administered to rats of the study group, beginning from 2 days preoperatively and for the duration of the experiment. In the same manner, placebo treatment was administered to rats of the control group. Animals were killed either 3 or 7 days after the operation, assessed for adhesion formation and colonic wound strength by means of bursting pressure measurement. Additionally, the point of rupture during the bursting pressure measurement was recorded. Anastomoses were opened and divided longitudinally into two equal parts. One half of the anastomosis was stained with hematoxylin and eosin in order to assess inflammatory cell composition and fibroblast reaction. Sections obtained from the anastomosis were subjected to immunohistochemistry with CD34 to evaluate microvessel formation. The other half was subjected to biochemical determination of MMP-2 and MMP-9 (zymography), proMMP-2, TlMP-1 and VEGF concentrations (ELISA). Further division of these specimens was undertaken in order to differentiate the anastomotic tissue from the normal tissue taken from the area just next to the anastomosis. Mean body weight decreased in the early postoperative period, but steadily increased during postoperative days 3 to 7 and reached the preoperative levels in groups sacrificed on postoperative day 7. No significant differences were found between study and control groups. Macroscopic assessment of adhesion formation revealed significantly fewer adhesions in study groups and especially in rats sacrificed on postoperative day 7, corresponding to the fact that those rats were exposed for longer time period to the antiangiogenic drug of the present study. No evident anastomotic dehiscence was found in all groups. Bursting pressure measurement showed a moderate decrease in rats that had received celecoxib, but without statistically significant differences between groups. The anastomotic strength increased on day 7 in both study and control groups. A shift was noted regarding the anastomotic rupture site. The anastomotic area was the site of rupture for the majority of rats sacrificed on postoperative day 3, but on day 7 the rupture mostly occurred away from the anastomosis, reflecting the increased anastomotic strength. Biochemical tissue analysis with zymography showed statistically significant reduction of the gelatin-degrading activity in rats that had received celecoxib, both in tissue samples from the anastomotic site and from areas next to the anastomosis. Interestingly, gelatine-degrading activity measured in anastomoses of the control group was significantly higher in samples from the anastomotic site than those from areas next to the anastomosis. Tissue concentration of proMMP-2 measured with ELISA revealed a significant reduction in rats that had received celecoxib, both in tissue samples from the anastomotic site and from areas next to the anastomosis. Similar results were noted when tissue concentration of VEGF was measured. On the other side, celecoxib did not affect tissue concentration of TIME-1. Histologic examination of sections originating from the anastomotic site stained with hematoxylin-eosin showed that the administration of celecoxib resulted in significant decrease of the inflammatory cell composition and fibroblast reaction compared to controls. The presence of newly formed microvessels, evaluated by CD34 immunohistochemistry, showed a small decrease in angiogenesis but without statistically significant differences between groups. Interpretation of these results leads to the conclusion that perioperative celecoxib administration results in reduction of the angiogenic process taking place on the healing anastomosis. Since MMPs are necessary for the degradation of vascular basal membrane facilitating endothelial cell migration and vessel formation, and VEGF is potent angiogenic promoter, the significantly lower levels of MMP and VEGF activity measured on samples originating from rats that had received celecoxib indicate suppression of angiogenesis. This antiangiogenic activity does not seem to alter the anastomotic strength which is measured by means of bursting pressure. We can therefore conclusively claim, based on the results of the present experimental study that the perioperative administration of celecoxib in colonic anastomosis rat model leads to reduction of parameters which reflect the angiogenic process on the anastomosis. This reduction however, does not correspond to impaired strength of the anastomosis which could lead to life threatening situations, such as anastomotic rupture and peritonitis.

Η κυκλοοξυγενάση (COX) είναι ένα ένζυμο το οποίο καταλύει τη μετατροπή του αραχιδονικού οξέος στα παράγωγα της προσταγλανδίνης. Έχουν ανευρεθεί δύο ισομορφές της COX, η COX-1, η οποία εκφράζεται συστηματικά στους ιστούς και η COX-2, η οποία εκφράζεται μόνο σε απάντηση σε εξωγενή ερεθίσματα γι' αυτό και θεωρείται ότι εμπλέκεται κυρίως σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η φλεγμονή, ο πόνος και ο πυρετός. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκε μια νέα κατηγορία μηστεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (ΜΣΑΦ), οι κοξίμπες. Τα φάρμακα της κατηγορίας αυτής στοχεύουν εκλεκτικά στις φλεγμονώδεις διεργασίες που μεσολαβούνται από τη δράση της COX-2, χωρίς να επηρεάζουν τους φυσιολογικούς ομοιοστατικούς μηχανισμούς που μεσολαβούνται από τη δράση της COX-1, στους οποίους αποδίδονται πολλές από τις ανεπιθύμητες ενέργειες των ΜΣΑΦ. Νεότερες έρευνες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι οι εκλεκτικοί αναστολείς της COX-2 παρουσιάζουν αντιαγγειογενετική δράση, με αποτέλεσμα να χρησιμοποιούνται ολοένα και περισσότερο στην προφύλαξη έναντι ορισμένων μορφών καρκίνου. Η αγγειογένεση όμως συνδέεται άμεσα και με τη διαδικασία της επούλωσης των ιστών και κατ’ επέκταση και των αναστομώσεων του παχέος εντέρου. Η ιδιαίτερη σημασία που αποκτούν οι αναστομώσεις του παχέος εντέρου οφείλεται στο γεγονός ότι η ανεπαρκής επούλωσή τους μπορεί να οδηγήσει σε επικίνδυνη για τη ζωή αναστομωτική διαφυγή και κατά συνέπεια και σε αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα. Επομένως, τίθεται το ερώτημα για το αν η αναστολή της COX-2 από τη σελεκοξίμπη επηρεάζει την επούλωση των αναστομώσεων παχέος εντέρου στους επίμυες. Για τη διεξαγωγή της παρούσας πειραματικής μελέτης χρησιμοποιήθηκε μοντέλο αναστόμωσης του παχέος εντέρου. Στο μοντέλο αυτό, πραγματοποιείται υπό αναισθησία εκτομή τμήματος παχέος εντέρου μήκους 1 cm, από σημείο περίπου 3 cm κεντρικά της ανάκαμψης του περιτοναίου και στη συνέχεια τελικοτελική αναστόμωση με 6-8 μεμονωμένες ραφές πολυπροπυλενίου 6/0. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε 72 επίμυες οι οποίοι χωρίσθηκαν σε δύο μεγάλες ομάδες που περιελάμβαναν από 36 επίμυες έκαστη, την ομάδα μελέτης και την ομάδα ελέγχου. Στην ομάδα μελέτης χορηγήθηκε τόσο προεγχειρητικά όσο και καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος ο εκλεκτικός COX-2 αναστολέας σελεκοξίμπη, μέσω στοματογαστρικού καθετήρα και σε δόση 10mg/kg βάρους σώματος, ενώ στην ομάδα ελέγχου χορηγήθηκε με τον ίδιο τρόπο placebo. Αμφότερες οι ομάδες χωρίσθηκαν περαιτέρω σε 2 υποομάδες ανάλογα με την ημέρα της θυσίας, δηλαδή την 3η ή την 7η μετεγχειρητική ημέρα. Πραγματοποιήθηκε καθημερινή καταγραφή του σωματικού βάρους των επίμυων και μετά τη θυσία, αφού αξιολογήθηκαν μακροσκοπικά οι ενδοκοιλιακές συμφύσεις, αφαιρέθηκε το τμήμα του παχέος εντέρου που περιελάμβανε την αναστόμωση με σκοπό την καταγραφή της πίεσης διάσπασης καθώς και του σημείου διάσπασης της αναστόμωσης. Ακολούθως, η αναστόμωση χωρίσθηκε σε δύο τμήματα. Το μισό στάλθηκε για ιστολογική εξέταση με χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης και ανοσοϊστοχημεία με CD34, ενώ το άλλο μισό για βιοχημική διερεύνηση των μεταλλοπρωτεϊνασών ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 (ζυμογραφία), του αναστολέα των μεταλλοπρωτεϊνασών ΤΙΜΡ-1 καθώς και του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα VEGF (ELISA). Το τμήμα του ιστού που απεστάλει για βιοχημικές αναλύσεις, διαχωρίσθηκε περαιτέρω σε δείγματα που προερχόταν από την αναστομωτική περιοχή και σε δείγματα που προέρχονταν από το φυσιολογικό ιστό πλησίον της αναστόμωσης με σκοπό να αναδειχθούν τυχόν διαφοροποιήσεις των βιοχημικών παραμέτρων ανάμεσα στους ιστούς των δύο αυτών περιοχών. Το σωματικό βάρος των επίμυων, αφού υποχώρησε κατά την άμεση μετεγχειρητική περίοδο, άρχισε να αυξάνεται στους επίμυες που θυσιάσθηκαν την 3η μετεγχειρητική ημέρα και έφτασε τα προεγχειρητικά επίπεδα στους επίμυες θυσίας 7 ημερών. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές του σωματικού βάρους από τη χορήγηση σελεκοξίμπης. Η μακροσκοπική αξιολόγηση των συμφύσεων ανέδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες ελέγχου και μελέτης που θυσιάσθηκαν την 7η μετεγχειρητική ημέρα, καθώς και μεταξύ των ομάδων μελέτης που θυσιάσθηκαν την 3η και την 7η μετεγχειρητική ημέρα. Σύμφωνα με την αξιολόγηση αυτή, η ομάδα μελέτης που θυσιάσθηκε την 7η μετεγχειρητική ημέρα παρουσίασε το μικρότερο βαθμό συμφύσεων, μιας και είναι η ομάδα η οποία εκτέθηκε για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στο χορηγούμενο αντιαγγειογενετικό παράγοντα της μελέτης. Επίσης, από τη μακροσκοπική εξέταση σε κανένα επίμυ δε βρέθηκε αναστόμωση η οποία παρουσίασε επιπλοκές, όπως αναστομωτική διαφυγή, περιαναστομωτικό απόστημα ή αποφρακτικό ειλεό. Η καταγραφή και η επεξεργασία των πιέσεων διάσπασης των αναστομώσεων έδειξε μικρή ελάττωση των πιέσεων διάσπασης στην ομάδα που έλαβε σελεκοξίμπη σε σχέση με τους μάρτυρες, αλλά χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά. Ταυτόχρονα παρατηρήθηκε η αναμενόμενη ενδυνάμωση των αναστομώσεων από την 3η μέχρι την 7η μετεγχειρητική ημέρα. Παράλληλα, το σημείο ρήξης της αναστόμωσης από την αναστομωτική περιοχή που εντοπίσθηκε στους επίμυες που θυσιάσθηκαν την 3η μετεγχειρητική ημέρα, μετατοπίσθηκε σε σημείο μακριά από την αναστόμωση στα πειραματόζωα που θυσιάσθηκαν την 7η μετεγχειρητική ημέρα. Η βιοχημική ανάλυση του ιστού της αναστόμωσης με ζυμογραφία ανέδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της ζελατινολυτικής δραστηριότητας στους επίμυες που έλαβαν σελεκοξίμπη σε σχέση με τους μάρτυρες, τόσο στα δείγματα που προήλθαν από το σημείο της αναστόμωσης όσο και στα δείγματα μακριά από την αναστόμωση. Στην ομάδα ελέγχου, που δε χορηγήθηκε σελεκοξίμπη, η ζελατινολυτική δραστηριότητα εμφανίζεται σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα της αναστόμωσης από αυτά μακριά από την αναστόμωση. Η μέτρηση της περιεκτικότητας της proMMP-2 με ELISA αποκάλυψε ότι η χορήγηση σελεκοξίμπης είχε ως αποτέλεσμα τη στατιστικά σημαντική μείωσή της στην ομάδα μελέτης τόσο στην 3η και 7η μετεγχειρητική ημέρα όσο και στα δείγματα απομακρυσμένα αλλά και εκατέρωθεν της αναστόμωσης. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν κατά τη μέτρηση της περιεκτικότητας των ιστών σε VEGF, με μείωση των επιπέδων της στις ομάδες 3ης και 7ης μετεγχειρητικής ημέρας που έλαβαν σελεκοξίμπη, αλλά και στα δείγματα εκατέρωθεν και μακριά από την αναστόμωση. Αντιθέτως, η σελεκοξίμπη δεν επέφερε σημαντικές αλλαγές στην περιεκτικότητα των ιστών σε ΤΙΜΡ-1. Η ιστολογική εξέταση των τομών που ελήφθησαν από την αναστόμωση και μετά από χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης έδειξε ότι η χορήγηση της σελεκοξίμπης είχε ως συνέπεια την στατιστικά σημαντική ελάττωση της φλεγμονώδους διήθησης της αναστομωτικής περιοχής στην ομάδα μελέτης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αντίστοιχη ελάττωση επέφερε η χορήγηση σελεκοξίμπης και στην ινοβλαστική αντίδραση στην αναστόμωση. Η παρουσία νέων αγγείων, η οποία επισημαίνεται με ανοσοϊστοχημική μέθοδο με CD34 ανέδειξε μικρή μείωση του αριθμού των αγγείων χωρίς όμως στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες. Από τα αποτελέσματα αυτά μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η χορήγηση της σελεκοξίμπης έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της αγγειογενετικής διαδικασίας η οποία είναι απαραίτητη για την επούλωση της αναστόμωσης. Η μείωση αυτή προκύπτει από την ελάττωση της ζελατινολυτικής δραστηριότητας των MMPs που καταγράφηκε καθώς και την ελάττωση του VEGF. Οι MMPs είναι αναγκαίες για την αποδόμηση της βασικής μεμβράνης των αγγείων βοηθώντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύσουν στην εξωκυττάρια ουσία και στη συνέχεια να οδηγήσουν στη δημιουργία νέου αγγείου και ο VEGF είναι ένας ισχυρός αγγειογενετικός παράγοντας με καίριο ρόλο στην επαγωγή της αγγειογένεσης. Η παρατηρούμενη όμως μείωση της αγγειογένεσης δε φαίνεται να επηρεάζει αρνητικά την πίεση διάσπασης της αναστόμωσης και κατ’ επέκταση και τη μηχανική ισχύ της αναστόμωσης. Συμπερασματικά λοιπόν μπορούμε να ισχυριστούμε, βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της πειραματικής μας μελέτης, ότι η περιεγχειρητική χορήγηση σελεκοξίμπης σε επίμυες, μειώνει την αγγειογένεση στην περιοχή της αναστόμωσης. Η μείωση αυτή όμως δε συνοδεύεται και από μείωση της ισχύος της αναστόμωσης η οποία μπορεί να οδηγήσει σε απειλητικές για τη ζωή επιπλοκές όπως η ρήξη και η περιτονίτιδα.