Κλωνοποίηση και μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου της από το NADP⁺-εξαρτώμενης αφυδρογονάσης του μηλικού του προβάτου

Abstract

Malic enzyme catalyzes the conversion of malate to pyruvate, simultaneously producing NADPH which is used in fatty acids biosynthesis. Besides malic enzyme, three more NADP⁺-dependent dehydrogenases are involved in the production of the NADPH molecules required for fatty acids biosythesis. A synchronized enzymatic action of the four dehydrogenases has been reported. The aim of the present thesis was the cloning and characterization of the cDNA and the regulatory region of the ovine malic enzyme gene as well as the study of its transcriptional regulation. In order to isolate the cDNA, several overlapping fragments were amplified by PCR and were cloned. Joining of the above fragments resulted in two malic enzyme transcripts. Transcript 1 consists of 2121 nucleotides and transcript 2 consists of 3243 nucleotides. While transcripts share the same 5’-UTR, the 3’-UTR of transcript 2 is longer than the 3’-UTR of transcript 1. The transcripts also share the same open reading frame which encodes for a protein consisted of 572 aminoacids. The ovine malic enzyme protein shares high similarity with the malic enzyme of other animals. In order to check whether malic enzyme is expressed in the liver, udder, muscle, adrenal gland, ovary, spleen, cerebellum, testis, kidney and heart, RT-PCR was performed in mRNA derived from the above tissues. Malic enzyme is expressed in all of the tissues checked. Malic enzyme mRNA levels were doubled in the adipose tissue when a refeeding treatment followed a fasting period. Two clones of an ovine BAC library, which resulted from PCR scanning, where used in order to clone the regulatory region. The cloned fragment contains 1175 bp upstream of the ATG start codon. The 200 bp of the 3’-end of this fragment share high similarity with human and rat corresponding regions. The cis-elements for API, T3R, Sp1 and PPAR found in human and rat regulatory regions are also present in the ovine regulatory region. Further in silico analysis revealed a putative Antioxidant Response Element and a putative Sterol Regulatory Element. The transcriptional activity of the regulatory region was studied by reporter gene assays in animal cells. The region containing the 139 bases upstream of the ATG codon has transcriptional activity. The region that carries the T3 Receptor cis-element (T3RE) has a negative effect in basal transcription. The replacement of the ovine T3RE with the human T3RE in the ovine promoter context, resulted in a significant increase of the basal activity in HepG2 and H4IIE but not in 3T3-L1 cells. The present thesis is the first study concerning the malic enzyme gene in ruminants. The results can contribute in the further study of the role of malic enzyme in sheep. They also can be used in comparative studies between ruminants and monogastrics. Finally, the present thesis can contribute in the study of the molecular mechanism which is responsible for the synchronized action of the four NADP⁺-dependent dehydrogenases.

Η κυτταροπλασματική NADP⁺-εξαρτώμενη μηλική αφυδρογονάση καταλύει την αντίδραση της μετατροπής του μηλικού σε πυροσταφυλικό με την ταυτόχρονη παραγωγή NADPH το οποίο χρησιμοποιείται στην βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Εκτός της μηλικής αφυδρογονάσης, άλλες τρεις NADP⁺- εξαρτώμενες αφυδρογονάσες συμμετέχουν στην παραγωγή NADPH που είναι απαραίτητα στη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων. Η δράση των τεσσάρων αφυδρογονασών έχει δειχτεί ότι είναι συγχρονισμένη. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η κλωνοποίηση του cDNA, η κλωνοποίηση της ρυθμιστικής περιοχής και η μελέτη της μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου της NADP⁺εξαρτώμενης μηλικής αφυδρογονάσης του προβάτου. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε για την απομόνωση του cDNA ήταν η ενίσχυση με PCR και η κλωνοποίηση αλληλοεπικαλυπτόμενων τμημάτων. Από την ένωση των παραπάνω τμημάτων προέκυψαν δύο μετάγραφα της μηλικής αφυδρογονάσης. Το μετάγραφο 1 αποτελείται από 2121 νουκλεοτίδια και το μετάγραφο 2 από 3243 νουκλεοτίδια. Τα δύο μετάγραφα φέρουν πανομοιότυπο 5’-UTR αλλά διαφέρουν ως προς το μήκος του 3’-UTR. Διατηρούν το ίδιο ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο και κωδικοποιούν για μία πρωτεΐνη 572 αμινοξέων η οποία παρουσιάζει υψηλό ποσοστό ομολογίας με τις μηλικές αφυδρογονάσες άλλων ζώων. Με RT-PCR ελέγχθηκε η έκφραση της μηλικής αφυδρογονάσης σε ήπαρ, μαστό, μυ, επινεφρίδια, ωοθήκη, σπλήνα, παρεγγεφαλίδα, όρχεις, νεφρό και καρδιά. Το γονίδιο εκφράζεται σε όλους τους παραπάνω ιστούς. Στο λιπώδη ιστό το επίπεδο του mRNA της μηλικής αφυδρογονάσης διπλασιάζεται όταν μετά από περίοδο νηστείας ακολουθήσει διατροφή κατά βούληση. Για την κλωνοποίηση της ρυθμιστικής περιοχής χρησιμοποιήθηκαν 2 κλώνοι μίας BAC βιβλιοθήκης προβάτου, οι οποίοι προέκυψαν μετά από σάρωση της βιβλιοθήκης με PCR. Κλωνοποιήθηκε μία περιοχή που περιέχει 1175 βάσεις άνωθεν του σημείου έναρξης της μετάφρασης. Το τμήμα που περιέχει τις περίπου 200 κατωφερικές βάσεις παρουσιάζει υψηλή ομολογία με τα αντίστοιχα τμήματα του ανθρώπου και του αρουραίου. Τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία μέσω των οποίων δρουν οι μεταγραφικοί παράγοντες API, T3R, Sp1 και PPAR, τα οποία έχουν χαρακτηριστεί στη μηλική αφυδρογονάση του ανθρώπου και του αρουραίου, εμφανίζονται συντηρημένα στο πρόβατο. Περαιτέρω in silico ανάλυση έδειξε ότι στην περιοχή εδράζεται ένα πιθανό Antioxidant Response Element και ένα πιθανό Sterol Regulatory Element. Η μεταγραφική ενεργότητα της ρυθμιστικής περιοχής μελετήθηκε με πειράματα διαμόλυνσης ζωικών κυττάρων. Η περιοχή που εκτείνεται στις 139 βάσεις άνωθεν του σημείου έναρξης της μετάφρασης παρουσιάζει μεταγραφική ενεργότητα. Η περιοχή που φέρει το cis-στοιχείο στο οποίο προσδένονται οι υποδοχείς της Τ3 (T3RE), επιδρά αρνητικά στη μεταγραφή σε HepG2 κύτταρα, όχι όμως και σε 3T3-L1. Όταν το T3RE αντικαταστάθηκε με το T3RE της μηλικής αφυδρογονάσης του ανθρώπου, η μεταγραφική ενεργότητα αυξήθηκε σημαντικά σε HepG2 και Η4ΙΙΕ κύτταρα, όχι όμως και σε 3T3-L1. Η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη μελέτη του γονιδίου της μηλικής αφυδρογονάσης στα μηρυκαστικά. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής μπορούν να συμβάλουν στην περαιτέρω μελέτη του ρόλου της μηλικής αφυδρογονάσης στο πρόβατο, καθώς επίσης και να χρησιμοποιηθούν σε συγκριτικές μελέτες της λιποσύνθεσης μεταξύ μηρυκαστικών και μονογαστρικών. Τέλος η παρούσα διατριβή μπορεί να συμβάλει στη μελέτη του μοριακού μηχανισμού που είναι υπεύθυνος για τη συγχρονισμένη δράση των τεσσάρων ΝΑDP⁺-εξαρτώμενων αφυδρογονασών.