Δομή, έκφραση και λειτουργική ανάλυση του θερμοεπαγόμενου γονιδίου hsp83 της μεσογειακής μύγας, Ceratitis Capitata

Abstract

By using the second exon of the D. auraria hsp83 gene as a probe, a number of overlapping cDNA clones were isolated from a Ceratitis capitata (medfly) cDNA library. The longest cDNA had a size of 2,593 bp and contained an open reading frame coding for a putative polypeptide of 715 amino acids with a predicted molecular weight of 81.74 kDa. In addition, it contained a part of the 5’-untranslated region and the complete 3’-untranslated region of a medfly hsp83 homolog, named Cchsp83. The predicted amino acid sequence showed a high degree of identity to all known sequences of the HSP90 family and was more closely related to the Drosophila HSP83 homologs. The putative medfly HSP83 contained all the conserved sequences of the members of the HSP90 family and was ended, at the C-terminal, with the pentapeptide MEEVD that characterizes all the cytosolic members of this family. Genomic Southern blot analysis, with several restriction enzymes and appropriate cDNA probes, indicated that the Cchsp83 gene exists as a single copy in the medfly genome. Northern blot hybridization revealed a single transcript of approximately 2.7 kb. In situ hybridization analysis showed that the Cchsp83 gene maps at the 94C region of the 6th chromosome (6R:94C), which corresponds to one of the major heat shock puffs of the medfly salivary gland polytene chromosomes. Evaluation of the Cchsp83 gene transcript and protein levels was performed by RT-PCR and western analysis, using total RNA and protein from synchronized animals. Anti-HSP83 antibodies were prepared against a histidine tag purified chimeric polypeptide from E. coli cells, transformed with a part of the coding region (aa 490-690) of the Cchsp83 cDNA. The response of the Cchsp83 gene to heat was fast and sensitive. Heat-induced transcript levels could be detected within 5 min at temperatures as low as 300C. Maximum transcript levels were obtained after 30-90 min treatments at 35-390C. Following recovery at 250C, after a 30 min heat shock, the accumulated transcripts remained at high levels for approximately 3h and declined to the non-induced levels 1h later. Developmental studies showed that the Cchsp83 gene is expressed constitutively throughout medfly development. At 250C, both transcript and protein levels were high in embryonic stages, low in larval stages and moderate in pupal and adult stages. Following heat shock at 380C, the transcript levels increased approximately 3- to 5-fold, depended on the developmental stage. Similar results were obtained for the protein levels after a heat shock at 350C, but not at 380C, suggesting that the Cchsp83 mRNAs are not translated efficiently at high temperatures. Screening of a genomic λEMBL-4A library from 24-h-old medfly embryos with the second exon of the D. auraria hsp83 gene, resulted in the isolation of a genomic clone containing part of the coding region, the untranslated leader region (5’ UTR) and 3.5 kb from the 5’ flanking region of the gene. Comparison of the genomic and cDNA nucleotide sequences revealed the presence of a small intron of 275 bp between the 5’ untranslated and coding regions of the gene. Thus the Cchsp83 gene is organized into two exons separated by a small intron. Computational analysis and 5’ RACE experiments, suggested that the putative transcription initiation site of the gene is located 144 bp upstream of the 5’ splicing site of the intron and 23 bp downstream of a typical TATA box (TATAΑΑΤΑ). Two putative heat shock elements (HSEs) were identified in the proximal 5’ flanking region of the gene, 35 and 330 bp, upstream of the TATA box. In addition to them, four distal HSEs, 1,595, 2,861, 2,880 and 2,890 bp, upstream of the putative transcription initiation site and one HSE inside the intron were identified. Functional analysis of the proximal 5’ flanking region of the Cchsp83 gene was performed by germline transformation. Three overlapping promoter fragments PL (-380/+139), PM (-86/+144) and PS (-55/+139), were fused to the lacZ reporter gene and the resulting constructs were introduced into the medfly genome via Minos-element mediated germline transformation. The expression of the reporter gene, in at least 8 homozygous transformed lines for each construct, was evaluated by quantitative β-galactosidase assays. The PM-lacZ and PS-lacZ lines did not show detectable levels of lacZ expression at neither normal or heat shock conditions.

Με στόχο την απομόνωση του γονιδίου hsp83 της μεσογειακής μύγας, πραγματοποιήθηκε διαλογή μιας cDNA βιβλιοθήκης από προνύμφες 3ου σταδίου, με ανιχνευτή το δεύτερο εξώνιο του hsp83 ομόλογου γονιδίου της Drosophila auraria. Από τη διαλογή αυτή προέκυψαν αρκετοί αλληλεπικαλυπτόμενοι κλώνοι, ο μεγαλύτερος των οποίων (CM-1) είχε μέγεθος 2.593 kb και περιελάμβανε ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο 715 αμινοξέων, από τη μετάφραση του οποίου προκύπτει ένα πολυπεπτίδιο προβλεπόμενου μοριακού βάρους 81,74 kDa. Η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία έδειξε πολύ μεγάλη ταυτότητα με όλα τα μέλη της οικογένειας HSP90 και ειδικότερα με τις HSP83 ομόλογες πρωτεΐνες της Drosophila. Επιπλέον, η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία περιείχε όλες τις συντηρημένες περιοχές των μελών της οικογένειας των HSP90 και στο καρβοξυτελικό της άκρο, έφερε το πενταπεπτίδιο MEEVD, το οποίο είναι χαρακτηριστικό όλων των κυτταροπλασματικών ισομορφών αυτής της οικογένειας. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα ο κλώνος CM-1, ονομάστηκε Cchsp83. Ο κλώνος αυτός, εκτός από ολόκληρη την κωδική περιοχή του γονιδίου, περιείχε μέρος της 5’ μη μεταφραζόμενης περιοχής και ολόκληρη την 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του hsp83 γονιδίου της μεσογειακής μύγας. Ανάλυση κατά Southern σε γονιδιωματικό DNA με διάφορα ένζυμα περιορισμού και κατάλληλους cDNA ανιχνευτές, έδειξε ότι το Cchsp83 γονίδιο υπάρχει σε ένα μόνο αντίγραφο στο γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας. Ανάλυση “Northern” έδειξε την ύπαρξη ενός μεταγράφου με μέγεθος 2,7 kb περίπου. Το Cchsp83 γονίδιο, χαρτογραφήθηκε με in situ υβριδοποίηση σε μία θερμοεπαγόμενη χρωμοσωματική διόγκωση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων του εντόμου (6R:94C). Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Cchsp83 έγινε σε επίπεδο RNA με RT-PCR σε ολικό RNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανάλυση Western σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα. Αντισώματα για την CcHSP83 αναπτύχθηκαν μετά από έκφραση ενός σημασμένου με 6 His τμήματος του Cchsp83 cDNA (490-690aa) σε βακτήρια E. coli. Η αντίδραση του Cchsp83 γονιδίου στην αύξηση της θερμοκρασίας είναι πολύ γρήγορη και ευαίσθητη. Μετάγραφα του γονιδίου ανιχνεύονται μετά από 5 λεπτά θερμικού στρες και σε θερμοκρασίες αρκετά χαμηλές (300C). Η επαγωγή του γονιδίου γίνεται μέγιστη μετά από 30-60 λεπτά θερμικού στρες στους 37-390C. Η επαναφορά της έκφρασης του γονιδίου στα φυσιολογικά επίπεδα μετά από θερμικό στρες είναι αργή, αφού για να γίνει αυτό απαιτούνται 4 ώρες ανάκαμψης στους 250C, μετά από μόλις 30 λεπτά θερμικού στρες στους 380C. Αναπτυξιακή μελέτη του προτύπου έκφρασης του Cchsp83 έδειξε ότι το γονίδιο εκφράζεται σε όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης της μεσογειακής μύγας. Στους 250C τόσο τα επίπεδα του RNA, όσο και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, είναι υψηλά στα εμβρυικά στάδια, χαμηλά στα προνυμφικά και μέτρια στα νυμφικά και ενήλικα στάδια. Μετά από θερμικό στρες στους 380C, τα επίπεδα των μεταγράφων αυξάνονται αρκετά, ιδιαίτερα στα στάδια που σε φυσιολογικές συνθήκες είναι χαμηλά. Όσον αφορά στα επίπεδα της πρωτεΐνης, τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια μετά από θερμικό στρες στους 350C, αλλά όχι στους 37-390C, όπου δεν παρατηρήθηκε καθόλου επαγωγή. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι σε υψηλές θερμοκρασίες καταστέλλεται η ωρίμανση ή και η μετάφραση του Cchsp83 RNA. Με στόχο την απομόνωση των ρυθμιστικών περιοχών του γονιδίου Cchsp83 της μεσογειακής μύγας, πραγματοποιήθηκε διαλογή μιας χρωμοσωματικής λEMBL-4A βιβλιοθήκης, με ανιχνευτή το δεύτερο εξώνιο του hsp83 ομόλογου γονιδίου της Drosophila auraria. Από τη διαλογή αυτή απομονώθηκαν δύο κλώνοι, ένας από τους οποίους περιελάμβανε μέρος της κωδικής περιοχής, την 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή και 3,5 kb της 5’ ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83. Σύγκριση της γονιδιωματικής αλληλουχίας με τη cDNA αλληλουχία, αποκάλυψε την ύπαρξη ενός μικρού εσωνίου 275 bp ανάμεσα στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή και στην αρχή της κωδικής περιοχής του γονιδίου. Βιοπληροφορική ανάλυση και πειράματα 5’ RACE, υποδηλώνουν ότι το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου βρίσκεται 144 bp ανοδικά του 5’ άκρου του εσωνίου και 23 bp καθοδικά ενός τυπικού στοιχείου TATA (ΤΑΤΑΑΑΤΑ). Δύο πιθανά στοιχεία απόκρισης στη θερμοκρασία (HSEs) εντοπίστηκαν στην εγγύς 5’ περιοχή του γονιδίου, 35 και 330 bp ανοδικά του στοιχείου TATA.